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細(xì)胞融合技術(shù)的應(yīng)用研究進(jìn)展

日期：2024-12-29 08:36
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摘要：

人們很早就注意到了在自然條件下發(fā)生的細(xì)胞融合現(xiàn)象，首先在病料組織中發(fā)現(xiàn)了由細(xì)胞融合產(chǎn)生的多核細(xì)胞，緊接著發(fā)現(xiàn)在脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物的正常細(xì)胞中也可發(fā)生細(xì)胞融合，隨后在體外組織培養(yǎng)中也發(fā)現(xiàn)了離體細(xì)胞的融合現(xiàn)象。自從發(fā)現(xiàn)活病毒可在體內(nèi)介導(dǎo)癌細(xì)胞融合后，人們又實(shí)現(xiàn)了利用滅活病毒促進(jìn)動(dòng)物異種細(xì)胞融合，從而打破了細(xì)胞融合的種屬屏障，推動(dòng)細(xì)胞融合技術(shù)躍上新的
臺(tái)階。原生質(zhì)體的大量制備較為困難，限制了植物細(xì)胞融合技術(shù)的發(fā)展，因此植物細(xì)胞融合的起步較動(dòng)物細(xì)胞融合要遲10年左右。直到用酶法大量制備有活力的原生質(zhì)體獲得成功后，才使植物原生質(zhì)體的融合工作迅速發(fā)展起來。由于病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合存在著病毒制備困難、操作復(fù)雜、滅活病毒的效價(jià)差異大等原因，人們又找到了比病毒簡(jiǎn)便、快速和高效且比病毒更易制備和控制，活性穩(wěn)定，使用方便的化學(xué)物質(zhì)PEG作為病毒的替代物誘導(dǎo)細(xì)胞融合，但在PEG誘導(dǎo)細(xì)胞融合的有效的濃度范圍內(nèi)(50～55)對(duì)細(xì)胞毒性很大，因此人們又找到了新的方法來替代PEG，這些新方法有電脈沖誘導(dǎo)細(xì)胞融合技術(shù)和激光融合技術(shù)以及空間融合技術(shù)等?？v觀細(xì)胞融合技術(shù)的發(fā)展歷史，該技術(shù)的不斷改進(jìn)首先表現(xiàn)在融合劑上，從致癌活病毒到滅活病毒再到化學(xué)物質(zhì)，其次體現(xiàn)在新方法上，再者體現(xiàn)在融合對(duì)象的不斷擴(kuò)展上。現(xiàn)在新的細(xì)胞融合方法一般采用將化學(xué)法和物理法結(jié)合起來進(jìn)行，如將磁、超聲、機(jī)械等和激光、電相結(jié)合，同時(shí)添加化學(xué)劑以便進(jìn)一步提高融合率，細(xì)胞融合的方法和手段始終朝操作方便、簡(jiǎn)單，便于量化研究，同時(shí)融合率又能得到不斷提高的
方向發(fā)展。

1． 細(xì)胞融合的意義

所謂細(xì)胞融合就是指在外力(誘導(dǎo)劑或促融劑)作用下，兩個(gè)或兩個(gè)以上的異源(種、屬間)細(xì)胞或原生質(zhì)體相互接觸，從而發(fā)生膜融合、胞質(zhì)融合和核融合并形成雜種細(xì)胞的現(xiàn)象稱為細(xì)胞融合或細(xì)胞雜交口]。如取材為體細(xì)胞則稱體細(xì)胞雜交，體細(xì)胞融合后可形成四倍體或多倍體細(xì)胞，由此形成的雜交細(xì)胞，其特性會(huì)有很大的變化。細(xì)胞融合不受種屬的局限，可實(shí)現(xiàn)種間生物體細(xì)胞的融合，使遠(yuǎn)緣雜交成為可能，因而是改造細(xì)胞遺傳物質(zhì)的有力手段。它的意義在于從此打破了僅僅依賴有性雜交重組基因創(chuàng)造新種的界限和生殖壁壘，極大地?cái)U(kuò)大了遺傳物質(zhì)的重組范圍；細(xì)胞融合技術(shù)避免了分離、提純、剪切、拼接等基因操作，在技術(shù)和儀器設(shè)備上的要求不象基因工程那樣復(fù)雜，投資少，有利于廣泛開展研究和推廣，有著重大的實(shí)踐意義，正得到科學(xué)界的日益重視[2_引。經(jīng)過長(zhǎng)期反復(fù)研究和實(shí)踐，細(xì)胞融合技術(shù)逐步發(fā)展和完善起來，已成為生物工程的基礎(chǔ)技術(shù)之一。特別是近20年來，從理論和實(shí)踐兩個(gè)方面，有力地推動(dòng)了生物科學(xué)各領(lǐng)域的發(fā)展。細(xì)胞融合方法得到了不斷的更新，融合率也得到逐步的提高。

2． 動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)

動(dòng)物細(xì)胞融合是從細(xì)胞水平來改變動(dòng)物細(xì)胞的遺傳性，用于生產(chǎn)單克隆抗體、疫苗等特定的生物制品，改良培育動(dòng)物新品種，縮短動(dòng)物的育種過程。動(dòng)物細(xì)胞融合的應(yīng)用范圍已廣及生物學(xué)的各個(gè)分支學(xué)科，特別是在繪制人類基因圖譜方面取得了顯著成績(jī)。雖然細(xì)胞雜交屬于理論生物學(xué)范疇，但在實(shí)際應(yīng)用方面也有重大突破。在基礎(chǔ)理論研究上，動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)對(duì)研究細(xì)胞分化、基因定位、腫瘤發(fā)生機(jī)制等方面都有重要意義。在實(shí)際應(yīng)用方面，動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)在**定向釋放系統(tǒng)、細(xì)胞**以及抗腫瘤**等方面起到重要的用。動(dòng)物體細(xì)胞雜交技術(shù)主要應(yīng)用于以下幾個(gè)方面。

2．1 用于基因定位和繪制人類基因圖譜

雜種細(xì)胞中某一染色體或其片段的存在與否與細(xì)胞的某一性狀表達(dá)與否相聯(lián)系，從而可以實(shí)現(xiàn)把基因定位于某一染色體或某一區(qū)段上。1967年Weise和Green發(fā)現(xiàn)在人和鼠的融合細(xì)胞中，人的染色體優(yōu)先丟失，并證明利用這一特點(diǎn)有可能對(duì)人染色體上的
基因進(jìn)行定位。1970年Ruddle等開始系統(tǒng)地用融合細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)來繪制人類基因圖。

2．2 用于生產(chǎn)樹突狀細(xì)胞抗腫瘤疫苗

一般認(rèn)為腫瘤細(xì)胞表面抗原不能誘導(dǎo)強(qiáng)的**應(yīng)答反應(yīng)，樹突狀細(xì)胞(dendriticcells，DCs)與腫瘤細(xì)胞融合形成的樹突狀細(xì)胞疫苗能夠有效地激發(fā)機(jī)體的細(xì)胞**應(yīng)答，無論是在動(dòng)物研究還是在人體早期臨床試驗(yàn)中都證明這是一種方便、**、可行的方法[4]。并且由于融合細(xì)胞可以在體內(nèi)存活，因此可以維持較長(zhǎng)時(shí)期的**應(yīng)答，有利于誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生有效的抗腫瘤**。腫瘤抗原可以肽段或完整蛋白的形式與DCs結(jié)合，或者將腫瘤抗原基因轉(zhuǎn)化進(jìn)DCs中，使其內(nèi)源性地表達(dá)抗原，這兩種方法在抗腫瘤**應(yīng)答中均有效-9]，但適于**的腫瘤抗原及其基因難以鑒定從而限制了其應(yīng)用]，有實(shí)驗(yàn)證明用這兩種方法制備的腫瘤疫苗的**原性不及腫瘤細(xì)胞與樹突狀細(xì)胞直接融合的異核細(xì)胞，融合細(xì)胞保持了DCs和腫瘤細(xì)胞的特性，并且能高效地將未知的腫瘤抗原提呈給**系統(tǒng)，今后腫瘤疫苗的研
究工作將集中在疫苗的純化上，以期用高度純化的雜合細(xì)胞來激發(fā)更為有效和強(qiáng)烈的**應(yīng)答反應(yīng)，使得這種方法在臨床應(yīng)用中更為實(shí)際.

2．3 用于生產(chǎn)單克隆抗體

使小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合形成能產(chǎn)生單克隆抗體(monoclonalantibody，McAb)的雜交瘤細(xì)胞，單克隆抗體具有專一性和靈敏性，作為理論研究的工具在病原檢測(cè)和****以及食品**領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。1985年，中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所研制成功抗北京鴨紅細(xì)胞和**細(xì)胞表面抗原的單克隆抗體，同時(shí)還與有關(guān)醫(yī)學(xué)部門合作，成功地制備了抗人肝癌和肺癌的單克隆抗體。在神舟**上我國(guó)自制的細(xì)胞電融合儀分別進(jìn)行了植物細(xì)胞的電融合試驗(yàn)和動(dòng)物細(xì)胞的電融合試驗(yàn)，動(dòng)物細(xì)胞電融合實(shí)驗(yàn)采用純化的乙肝疫苗病毒表面抗原**的小鼠B**細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞，目的是獲得乙肝單克隆抗體。目前有關(guān)單位利用McAb作用的專一性這一特點(diǎn)正在探索用“生物導(dǎo)彈”對(duì)癌癥進(jìn)行早期診斷和**。

2．4 用于動(dòng)物育種

體細(xì)胞核移植技術(shù)(somatic cell nucleartransfertechnique，SCNT)是將細(xì)胞核移植到另一細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的生物技術(shù)。動(dòng)物體細(xì)胞融合后，雜種細(xì)胞難以發(fā)育再生為一個(gè)個(gè)體，但借助于細(xì)胞核移植的方法將融合后雜種細(xì)胞的細(xì)胞核移入去核成熟卵內(nèi)，可培育新的雜種。另外，細(xì)胞核移植技術(shù)的建立，還為目前進(jìn)行的哺乳動(dòng)物體細(xì)胞克隆和轉(zhuǎn)基因技術(shù)打下良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)[1]。

2．5 用于細(xì)胞療法

SCNT將患者的任何體細(xì)胞與去核卵細(xì)胞融合，融合子進(jìn)行有絲分裂形成囊胚，囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)是多能干細(xì)胞，對(duì)多能干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)使其定向分化可形成所需的組織和器官用于器官移植，不僅解決了器官和組織來源問題，并且也避免了宿主對(duì)外來物的**排斥。

2．6 動(dòng)物體細(xì)胞融合在基礎(chǔ)理論研究方面的應(yīng)用

(1)用于研究細(xì)胞的核質(zhì)關(guān)系和個(gè)體發(fā)育。

2o世紀(jì)7O年代初，誕生了細(xì)胞拆合工程。Carter于1967年發(fā)現(xiàn)細(xì)胞松弛素B(CB)能誘發(fā)體外培養(yǎng)的小鼠L細(xì)胞的排核作用。Prescott等1972年首先應(yīng)用離心術(shù)結(jié)合CB分離哺乳類細(xì)胞的胞質(zhì)體獲得成功，為研究哺乳類細(xì)胞的核、質(zhì)相互關(guān)系、細(xì)胞質(zhì)基因的轉(zhuǎn)移開創(chuàng)了新的途徑C1zJ。異核體和細(xì)胞雜合子被用來確定基因調(diào)節(jié)因子，這些調(diào)節(jié)因子決定一個(gè)細(xì)胞表型消失或得以保持以及賦予受體新性狀；通過對(duì)供體和受體細(xì)胞所有細(xì)胞特異性基因表達(dá)研究，細(xì)胞融合有助于人們了解發(fā)育，特別是在研
究基因編碼的可逆性方面。在個(gè)體發(fā)育過程中，血紅蛋白存在著從胚胎型向胎兒型(幼蟲)*終向**型的轉(zhuǎn)換，對(duì)這些轉(zhuǎn)換進(jìn)行研究，除了揭示基因順序表達(dá)的調(diào)控機(jī)理外，在醫(yī)學(xué)方面也有意義，人們可以部分或全部扭轉(zhuǎn)從胚胎型向胎兒型的轉(zhuǎn)變從而**鐮刀型貧血病。

(2)用于揭示**發(fā)生的機(jī)制。

與其他技術(shù)結(jié)合使用，細(xì)胞融合是一種揭示**機(jī)理的有效方法。例如，細(xì)胞融合與**熒光，生化分析，電鏡技術(shù)相結(jié)合，LattanziG等對(duì)肌肉萎縮癥發(fā)生的機(jī)理進(jìn)行了研究cH]。

(3)用于膜蛋白動(dòng)力學(xué)研究。

細(xì)胞融合技術(shù)與顯微鏡技術(shù)結(jié)合使用被用來研究膜蛋白動(dòng)力學(xué)以及這些膜蛋白之間的關(guān)系，P6terNagy等的研究發(fā)現(xiàn)大型膜蛋白群之間(主要組織相容性復(fù)合物majorhistocompatibilitycomplex，MHC，包括MHC I和MHClI)發(fā)生蛋白質(zhì)交換，并且群內(nèi)蛋白之間也發(fā)生蛋白移位，小蛋白群之間也存在著蛋白重排現(xiàn)象。

3． 植物細(xì)胞融合技術(shù)

植物細(xì)胞融合技術(shù)目前主要是作為擴(kuò)大變異的手段，同時(shí)也正朝著將抗藥性和胞質(zhì)雄性不育等細(xì)胞質(zhì)基因?qū)肆硪粋€(gè)體細(xì)胞的方向發(fā)展，有可能形成新的核質(zhì)雜種。如果獲得了有用性狀的細(xì)胞系，在還不能形成植株時(shí)，就可以通過快速大量繁殖細(xì)胞加以利用。在生產(chǎn)應(yīng)用研究方面，植物細(xì)胞融合在育種上有重要的應(yīng)用價(jià)值，通過誘導(dǎo)不同種問、屬問甚至不同科問原生質(zhì)體的融合，可能打破有性雜交不親和性的界限，廣泛地組合各種基因型，從而有可能形成有性雜交方法所無法獲得的新型雜種植株；另一方面又可將各種細(xì)胞器、DNA、質(zhì)粒、病毒、**等外源遺傳物質(zhì)引入原生質(zhì)體，從而有可能引起細(xì)胞遺傳性的改變，為某些**植物的快速繁殖、植物的復(fù)壯等提供了可行的方法，應(yīng)用于植物育種、種質(zhì)保存、無性系的快速繁殖和有用物質(zhì)生產(chǎn)等。植物細(xì)胞融合配合常規(guī)育種技術(shù)，可望選出優(yōu)良材料，加之體細(xì)胞雜交來自雙親的遺傳物質(zhì)并非簡(jiǎn)單的堆積，而是發(fā)生了復(fù)雜的遺傳重組，這正是改良作物所期望的。植物細(xì)胞融合的作用主要表現(xiàn)在以下方面：通過植物細(xì)胞融合培育抗病新材料；合成新的物種，轉(zhuǎn)移細(xì)胞質(zhì)基因。原生質(zhì)體新培養(yǎng)體系的研究將會(huì)提高融合率。YamagishiH等[】設(shè)計(jì)了一種新的高效原生質(zhì)體培養(yǎng)體系，增加了不對(duì)稱雜交屬內(nèi)種間細(xì)胞融合率可以設(shè)想，細(xì)胞融合技術(shù)發(fā)展后，可以把人參和蟲草的細(xì)胞融合，產(chǎn)生新的品種，并具備它們各自特有的
藥效，這是非常有意義的事。

4． 微生物細(xì)胞融合技術(shù)

用于植物和微生物育種是細(xì)胞融合技術(shù)*基本的應(yīng)用領(lǐng)域。對(duì)微生物而言，該技術(shù)主要用于改良微生物菌種特性、提高目的產(chǎn)物的產(chǎn)量、使菌種獲得新的性狀、合成新產(chǎn)物等。與基因工程技術(shù)相結(jié)合，使對(duì)遺傳物質(zhì)進(jìn)一步修飾提供了各種各樣的可能性。目前，微生物細(xì)胞融合的對(duì)象已擴(kuò)展到酵母、霉菌、**、放線菌等多種微生物的種間以至屬間，不斷培育出用于各種領(lǐng)域的新菌種。自1979年匈牙利的Pesti首先利用微生物原生質(zhì)體融合技術(shù)提高青霉素產(chǎn)量以來，開創(chuàng)了原生質(zhì)體融合技術(shù)在實(shí)際工作中的應(yīng)用。微生物細(xì)胞融合技術(shù)的一項(xiàng)突出應(yīng)用是生物藥品的生產(chǎn)，包括***、生物活性物質(zhì)、疫苗等，它適用于**的診斷、預(yù)防及**等。另一方面的突出應(yīng)用就是為發(fā)酵工業(yè)提供優(yōu)良菌種，例如日本味之素公司應(yīng)用細(xì)胞融合技術(shù)使產(chǎn)生氨基酸的短桿菌雜交，獲得比原產(chǎn)量高3倍的賴氨酸產(chǎn)生菌和蘇氨酸高產(chǎn)新菌株。釀酒酵母和糖化酵母的種間雜交，分離子后代中個(gè)別菌株具有糖化和發(fā)酵的雙重能力。日本國(guó)稅廳釀造試驗(yàn)所用該技術(shù)獲得了優(yōu)良的高性能謝利酵母來釀制西班牙謝利白葡萄酒獲得了成功。在基礎(chǔ)理論方面，研究外源DNA轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒轉(zhuǎn)移、基因定位、病毒傳遞以及核與核、核與質(zhì)之間的關(guān)系等已取得重大進(jìn)展。

歐盟生物實(shí)驗(yàn)室設(shè)備與維護(hù)集團(tuán)（BiologicalLaboratoryEquipment, MaintenanceandServiceLtd.簡(jiǎn)稱：BLS）,BLS公司是歐洲一家專業(yè)生產(chǎn)電融合設(shè)備的廠家，尤其在胚胎干細(xì)胞的電融合上面更具有全球****的技術(shù)。BLS細(xì)胞融合儀CF-150B和相關(guān)電極槽(GSS-250)專為哺乳動(dòng)物胚胎分裂球電融合而設(shè)計(jì)，可在電解液或非電解液中運(yùn)用。一個(gè)適當(dāng)導(dǎo)向的短電脈沖施加在早期胚胎可以溶解細(xì)胞膜，從而完成細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核融合。此細(xì)胞融合儀的主要應(yīng)用是產(chǎn)生小鼠四倍體胚胎產(chǎn)生和體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移克隆。

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