黃曲霉**B1檢測(cè)試劑

酶標(biāo)**分析定量測(cè)定黃曲霉**B1試劑盒。德國(guó)公司R-Biopharm制造（中文翻譯件僅供參考，以試劑盒內(nèi)附的英文原件為準(zhǔn)）

RIDASCREEN Aflatoxin B1 30/15（產(chǎn)品編號(hào)：R1211）

簡(jiǎn)介

    采用競(jìng)爭(zhēng)酶標(biāo)**法定量測(cè)定谷物，飼料，花生，干果及其它食品中的黃曲霉**B1。試劑盒中包括了所有檢測(cè)用的試劑。該試劑盒有96個(gè)試驗(yàn)孔包括標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)，如果進(jìn)行定量分析，必須有微孔板酶標(biāo)儀。

樣品制備

谷物/飼料：粉碎，甲醇/水提取，過(guò)濾，稀釋

時(shí)間要求：（以10個(gè)樣品為例）

谷物/飼料………………………………….……大約30分鐘

測(cè)試時(shí)間………………………………………….大約1小時(shí)

（與樣品數(shù)量多少無(wú)關(guān)）

檢測(cè)下限    1ppb

回收率      80-100%

交叉反應(yīng)

Aflatoxin B1…………………………………………….100%

Aflatoxin G1…………………………………………..大約29%

Aflatoxin B2………………………………………….大約13%

Aflatoxin G2…………………………………………大約3.2%

Aflatoxin M1…………………………………………大約1.5%

1.  用途

Aflatoxin B1 30/15競(jìng)爭(zhēng)酶標(biāo)**法定量測(cè)定谷物，飼料中的黃曲霉**B1。

2.  概要

黃曲霉**主要是兩種霉菌Aspergillus flavus 及 A.paraticus的二級(jí)代謝物。這些霉菌在濕熱的環(huán)境和耕作土地上污染的植物產(chǎn)生。黃曲霉**B1屬于自然*強(qiáng)烈的致癌物質(zhì)。

黃曲霉**B1作為毒性*高的的分析物，它一般產(chǎn)生于玉米，花生，巴西堅(jiān)果和棉花種子中。

鑒于這種霉菌**的毒性，歐洲國(guó)家做出了相近的限量，對(duì)黃曲霉**B1的限量為2ppb，對(duì)黃曲霉**總量的限量為4ppb。

使用RIDASCREEN Aflatoxin B1 30/15檢測(cè)試劑盒，能夠快速而準(zhǔn)確的檢測(cè)谷物，飼料和其他食品中的黃曲霉**B1。

3.   測(cè)定原理

測(cè)定的基礎(chǔ)是抗原抗體反應(yīng)。微孔板包被有針對(duì)黃曲霉**B1抗體的捕捉抗體。加入標(biāo)準(zhǔn)或樣品溶液、黃曲霉**酶標(biāo)記物和黃曲霉**抗體。游離黃曲霉**與黃曲霉**酶標(biāo)記物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合黃曲霉**抗體，同時(shí)黃曲霉**抗體與固定在板孔的捕捉抗體相連接。沒(méi)有連接的酶標(biāo)記物在洗滌步驟中被除去。將酶基質(zhì)/發(fā)色劑加入到孔中并且孵育。結(jié)合的酶標(biāo)記物將微紅色的發(fā)色劑轉(zhuǎn)化為藍(lán)色的產(chǎn)物。加入反應(yīng)停止液后使顏色產(chǎn)生由藍(lán)色變成黃色。在450nm處測(cè)量，吸光值與樣品中的濃度成反比。

4.  提供的試劑

每一個(gè)盒中的試劑足夠進(jìn)行96個(gè)測(cè)量（包括標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定孔）

盒中的材料如下

1×96孔板（12條 X  8孔）包被有捕捉抗體

6×黃曲霉**B1標(biāo)準(zhǔn)液，1.3 ml/瓶

濃度為：0ppb，1ppb， 5ppb，10ppb，20ppb，50ppb

黃曲霉**B1的甲醇/水溶液

1×酶標(biāo)記物（6ml）………………………………….紅色帽

過(guò)氧化物酶標(biāo)記物的黃曲霉**B1

1×黃曲霉B1抗體（6ml）……………………………黑色帽

1×基質(zhì)/發(fā)色劑（10ml）……………………………..藍(lán)色帽

1×反應(yīng)停止液（14ml）...….…………………... ……黃色帽

為1N硫酸

1×洗滌緩沖液

為10Mm的磷酸緩沖液（pH7.4），包含0.05%的Tween20

*   樣品的10倍稀釋倍數(shù)已經(jīng)考慮，因此，樣品中黃曲霉B1的濃度可以直接在標(biāo)準(zhǔn)曲線讀取。

5. 需要的材料但盒中不提供

5.1設(shè)備

－－－－微孔板酶標(biāo)儀（450nm）定量分析用

－－－－100ml量筒

－－－－樣品提取用玻璃器皿：漏斗、50ml容量瓶

－－－－粉碎機(jī)

－－－－振蕩器

－－－－Whatman ****或相當(dāng)?shù)臑V紙

－－－－50ul，100ul，1000ul微量加樣器

5.2 試劑

－－－－甲醇

－－－－70%甲醇溶液：準(zhǔn)備70%甲醇溶液，70ml甲醇與30ml蒸餾水混合。

－－－－蒸餾水或去離子水

6.  操作者應(yīng)該注意之事項(xiàng)

－－－－標(biāo)準(zhǔn)液含有黃曲霉**B1，要特別小心，應(yīng)戴手套，避免試劑接觸皮膚

－－－－使用過(guò)的玻璃容器*好用pH7的次氯酸溶液（10%V/V）浸泡過(guò)夜

－－－－反應(yīng)停止液為1N硫酸，避免接觸皮膚

－－－－不要使用過(guò)了有效日期的試劑盒，稀釋或攙雜使用會(huì)引起 

  靈敏度的降低

－－－－不要交換使用不同批號(hào)的盒中試劑

7.   儲(chǔ)存條件

－－－－保存試劑盒于2-80C。不要冷凍

－－－－將不用的微孔板放進(jìn)原錫箔袋中并且與提供的干燥劑一起重新密封

－－－－標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)光敏感，因此要避免直接暴露在光線下

－－－－基質(zhì)/發(fā)色劑對(duì)光敏感，因此要避免直接暴露在光線下

8. 試劑變質(zhì)的跡象

紅的基質(zhì)/發(fā)色試劑若顯藍(lán)色表明發(fā)色劑變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。

0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.6個(gè)單位 （A450nm<0.6）時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)。< span="">

9. 樣品處理 

樣品應(yīng)當(dāng)在陰涼避光之處保存

在分析前將代表性的樣品粉碎，徹底混均

－－－－稱(chēng)取5g 粉碎的樣品于適當(dāng)容器中，加入25ml 70%甲醇溶液

－－－－強(qiáng)力振蕩3分鐘（用手或振蕩器）

－－－－用Whatman ****或相當(dāng)?shù)臑V紙進(jìn)行過(guò)濾

－－－－取1ml濾液加入1ml蒸餾水稀釋

－－－－取50ul稀釋液用于試劑盒分析

*根據(jù)需要可以增加樣品量，但甲醇溶液的量也應(yīng)相應(yīng)增加 （例如：樣品10g+50ml 70%甲醇溶液）

注意

如果樣品中黃曲酶**的濃度比預(yù)計(jì)的濃度高，樣品需要進(jìn)一步稀釋。請(qǐng)注意加入到微孔中分析的樣品必須是比例為35/65的甲醇/水溶液。

10.  酶標(biāo)**分析程序

10.1測(cè)定之前注意事項(xiàng)

1. 用之前將所有試劑回升至室溫（20-25℃）。

2. 使用之后立即將所有試劑放回2-8℃。 

3. 在使用中不要讓微孔干燥。

4. 在EIA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，仔細(xì)按照推薦的洗板順序操作是EIA測(cè)定程序中的要點(diǎn)。

5. 在所有恒溫孵育過(guò)程中，避免光線照射，用蓋子蓋住微孔板。

10.2包被有抗體的微孔板條

錫箔袋沿橫向邊壓封線外側(cè)剪開(kāi)。取出需用數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板放進(jìn)原錫箔袋中并且與提供的干燥劑一起重新密封，保存于2-80C。不要冷凍.

10.3標(biāo)準(zhǔn)液

黃曲霉**B1標(biāo)準(zhǔn)液直接應(yīng)用，樣品的10倍稀釋倍數(shù)已經(jīng)被考慮，因此，樣品的黃曲霉B1的濃度可以直接在標(biāo)準(zhǔn)曲線讀取。

10.4  洗滌緩沖液

在試劑盒中提供一包洗滌緩沖液的粉劑，一包粉劑溶解于1升的蒸餾水中，制備好的洗滌緩沖液在4oC條件下保存4周。

方法二：

將小袋里粉劑只用100ml蒸餾水溶解得到一個(gè)10倍的緩沖液濃縮液。此溶液在室溫（20-25°C）下，可保存8周。

使用時(shí)，1倍的濃縮液+9倍的蒸餾水稀釋即可得到待用的洗滌緩沖液

10.5測(cè)定程序  （在20-25 oC條件下操作）

1．將足夠標(biāo)準(zhǔn)和樣品所用數(shù)量的孔條插入微孔架，標(biāo)準(zhǔn)及樣品做平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)及樣品的位置。

2.加入50ul的標(biāo)準(zhǔn)或處理好的樣品到各自的微孔中，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)和樣品必須使用新的吸頭。

3.加入50ul酶標(biāo)記物（紅色帽）到微孔底部。

4.加入50ul黃曲霉抗體（黑色帽）到微孔底部，輕輕地在桌面振擺酶標(biāo)板，使之混合。在室溫（20-25 oC）孵育30（+/-1）分鐘

5.倒出孔中的液體，將微孔架倒置在吸水紙上拍打以保證完全除去孔中的液體。每孔注入250ul洗滌緩沖液。再次倒出孔中的液體，完全除去孔中的液體，重復(fù)操作洗滌步驟兩次以上。

6.加入100ul基質(zhì)/發(fā)色試劑（藍(lán)色帽）到微孔中，充分混合并在室溫暗處孵育15（+/-1）分鐘。

7.加入100ul反應(yīng)停止液到微孔中，混合好在450nm處測(cè)量吸光度值，以空氣為空白，15分鐘內(nèi)讀取光度值。

11.  結(jié)果

所獲得的標(biāo)準(zhǔn)和樣品吸光度值的平均值除以**個(gè)標(biāo)準(zhǔn) （0標(biāo)準(zhǔn)） 的吸光度值再乘以100。因此0標(biāo)準(zhǔn)等于100%并且以百分比給出吸光度值。

標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值（或樣品）

－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－x 100= %吸光度值

0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值

計(jì)算的標(biāo)準(zhǔn)值繪成為一個(gè)以黃曲霉**B1濃度（ng/kg）的半對(duì)數(shù)坐標(biāo)系統(tǒng)曲線圖，校正曲線在5-20ppb范圍內(nèi)應(yīng)當(dāng)成為線性，相對(duì)應(yīng)每一個(gè)樣品的濃度可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出。

12．  靈敏度

RIDASCREEN Aflatoxin B1 30/15試劑盒的*低檢測(cè)下限為大約1ppb

13．  特異性

RIDASCREEN黃曲霉**B1試劑盒的特異性通過(guò)對(duì)相應(yīng)的物質(zhì)進(jìn)行交叉反應(yīng)性分析而得到：

Aflatoxin B1………………………………………..……100%

Aflatoxin G1…………………………………………大約29%

Aflatoxin B2………………………………………..大約13%

Aflatoxin G2……………….………………………...大約3.2%

Aflatoxin M1………….……………………….……..大約1.5%

14. 再現(xiàn)性

由三個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定了室內(nèi)精密度，圖2顯示出RIDASCREEN Aflatoxin B1 30/15試劑盒的精密度情況，獲得的標(biāo)準(zhǔn)吸收值的變異系數(shù)（%CV）對(duì)相應(yīng)黃曲霉**B1濃度作曲線，可以看到在全部范圍內(nèi)變異系數(shù)如此之低，可以得到很好的再現(xiàn)性。

15.  回收率

谷物類(lèi)樣品黃曲霉**B1的回收率80-100%，平均變異系數(shù)大約為8%

16.  參考文獻(xiàn)

見(jiàn)試劑盒中提供的英文原版說(shuō)明書(shū)。