乳酸桿菌(LB)核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)
規(guī)格：50次
價格：5860元
產(chǎn)品及特點
乳酸桿菌是可使葡萄糖等糖類分解為乳酸的各種細的總稱。乳酸菌是一種無芽孢
的桿菌，屬革蘭氏陽性菌，厭氧性呼吸。廣泛分布于自然界，有些菌株是人和動物口
腔、腸道及道的正常菌群之一，很少致病，除極偶爾引起亞急性細性心內(nèi)膜炎外，
對人基本無害。寄生于口腔的乳酸桿菌在齲齒發(fā)生中起重要作用。一般認為寄生于腸
道和道的乳酸桿菌對機體有保護作用某些乳桿菌如嗜酸性乳桿菌、保加利亞乳桿菌，
常用于飲料的發(fā)酵工業(yè)。本公司開發(fā)乳酸桿菌屬通用染料法熒光定量 PCR 試劑盒，它
具有下列特點：
1. 即開即用，用戶只需要提供 DNA 模板。
2. 引物根據(jù)乳酸桿菌屬專一區(qū)設計，特異性高。
3. 熒光定量 PCR 檢測，比常規(guī) PCR 更加靈敏。
4. 一管式閉管操作，降低了交叉污染。
5. 本試劑盒足夠 50 次 20μL 反應體系的熒光定量 PCR。
6. 本產(chǎn)品只適用于科研，不能用于臨床診斷。
乳酸桿菌屬通用染料法熒光定量PCR試劑盒規(guī)格及成分
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成分
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編號
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十孔盒包裝
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2×qPCR MagicMix
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A
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500μL（棕色管）
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熒光 PCR 專用模板稀釋液
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1 mL（黃蓋）
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乳酸桿菌屬通用PCR 引物混合物
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C
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100μL（白蓋）
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乳酸桿菌屬通用 PCR 陽性對照(1×10E8 拷貝/μL)
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D
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50μL（紅蓋）
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DNA 病毒裂解液（試用裝）
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E
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15 次（9 mL）
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使用手冊
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F
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1 份
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運輸及保存： 低溫運輸，-20℃保存，有效期一年。
自備試劑：DNA 模板、10×ROX（根據(jù)機型決定，具體見使用方法）。
乳酸桿菌屬通用染料法熒光定量PCR試劑盒使用方法
一、稀釋 PCR 陽性對照（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）
1. 注意：由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供可以直接使用的 DNA 片段作為陽性對照。
2. 標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。
3. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液（*好用帶芯槍頭，下同）。
4. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照，充分震蕩 1 分鐘，得1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
5. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
6. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照到 5 號管中，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
7. 重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。
二、樣品DNA的制備
8. 如果有N個樣品，必須設置N+2個提取，多出的一個是PC（樣品制備陽性對照），一個是NC（樣品制備陰性對照）。可以用 10μL上步制備的PCR 陽性對照的第4號（濃度為 1×10E4 拷貝/μL，10μL相當于1萬拷貝）或第5號（濃度為1×10E5拷貝/μL，10μL 相當于10萬拷貝）再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。如果每次制備需要200μL樣品，則PC和NC的體積也必須是200μL。
9. 用自選方法純化樣品的DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒DNA提取試劑盒兼容。也可以選購本公司的一管式病毒DNAout 或其升級版柱式病毒DNAout。本試劑盒免費贈送15次一管式病毒DNAout。
三、設置qPCR反應（20μL體系，在樣品制備室進行）
10. 如果只做1次重復，則標記N+9個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個
樣品，1個用于PCR陰性對照，6個用于PCR陽性對照。如果做2-3次重復，則反應設置數(shù)量相應增加2或3倍。
11. 在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后*后加）：
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成分
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樣品管
N+2 個
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PCR 陰性
對照管
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PCR 陽性
對照管（2-7 管）
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2×qPCR MagicMix
（棕色管）
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10 μL
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10 μL
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各 10 μL
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乳酸桿菌屬通用 PCR
引物混合液（白蓋）
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2 μL
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2 μL
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各2 μL
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自備 10×ROX (見注)
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2 μL
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2 μL
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2 μL
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N+2 待測樣品 DNA 模板
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6 μL
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不加
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不加
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第 7 步所得 PCR 陽性對照稀釋液（2-7 號）
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不加
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不加
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各 6μL（2 號樣到
2 號管，3 號樣到 3
號管…）
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注:僅 ABI7500、7700 和 7900 儀器需要使用 ROX 作為對照，其他熒光PCR儀器（如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480）不需要使用 ROX，則用水替代。
12. 蓋上蓋子后上機，按下面參數(shù)進行PCR（具體PCR參數(shù)可以根據(jù)儀器不同而自行優(yōu)化）。
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過程
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溫度
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時間
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預變性
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92℃
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5 分鐘
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PCR 反應（35 個循環(huán)）
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94℃
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60 秒
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50℃
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60 秒
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72℃
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60 秒
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13. 數(shù)據(jù)采集
具體操作按所用儀器推薦的流程進行。本產(chǎn)品中所含的熒光染料在不結合 DNA 時，*大吸收光譜在 471 nm，結合 DNA 時的*大吸收光譜在 500 nm，*大發(fā)射光譜在 530 nm。信號采集可以設置在復性或延伸步驟。
四、數(shù)據(jù)處理
14. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品 DNA 濃度的log 值，再推算出其濃度。
15. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴增曲線，Ct 值應該小于或等于30。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復一次。重復實驗的 Ct 值如果大于或等于 40 則為陰性，如果小于 40，則為陽性。
五、熒光定量PCR技術的基礎理論：
1、熒光定量PCR線性關系成立的條件分析 、熒光定量PCR線性關系成立的條件分析。
左圖橫坐標是PCR循環(huán)次數(shù)，縱坐標是總的熒光強度Rn,改圖反映的是各個樣品隨著 左圖橫坐標是PCR循環(huán)次數(shù)，縱坐標是總的熒光強度Rn,改圖反映的是各個樣品隨著 每輪PCR反應，其總的熒光量的實時變化；右圖橫坐標也是PCR循環(huán)次數(shù)，縱坐標是 每輪PCR反應，其總的熒光量的實時變化；右圖橫坐標也是PCR循環(huán)次數(shù)，縱坐標是 總的熒光強度與熒光本底的差值RT RB即△Rn的對數(shù)，在右圖中確定閾值線，該直 總的熒光強度與熒光本底的差值RT –RB即△Rn的對數(shù)，在右圖中確定閾值線，該直 線上所有樣品的RT RB的對數(shù)都相同，熒光定量PCR的線性關系才會成立。 線上所有樣品的RT –RB的對數(shù)都相同，熒光定量PCR的線性關系才會成立。
