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分光光度計(jì)的結(jié)構(gòu)與使用方法
日期：2024-12-22 10:40
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摘要：分光光度計(jì)的結(jié)構(gòu)與使用方法
分光光度計(jì)的結(jié)構(gòu)與使用方法
1.2 特點(diǎn)：靈敏、準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便，在復(fù)雜的組分體系中，無(wú)需分離，即可以檢測(cè)其中所含的極少量物質(zhì)。
1.3 應(yīng)用：生物<>化學(xué)研究中廣泛使用的方法之一，廣泛應(yīng)用于糖類(lèi)、蛋白質(zhì)、核酸、酶類(lèi)等的快速定量檢測(cè)。
二、分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)和工作原理
2.1 分光光度計(jì)的分類(lèi)
2.2 分光光度計(jì)工作原理
2.3 分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)\ n2.4 分光光度計(jì)的測(cè)量誤差
2.5 顯色反應(yīng)及其影響因素
2.1 分光光度計(jì)的分類(lèi)
分光光度計(jì)的分類(lèi)
紅外分光光度計(jì)：測(cè)量波長(zhǎng)范圍大于 760 nm 紅外光區(qū)
可見(jiàn)分光光度計(jì)：測(cè)量波長(zhǎng)范圍為400~760 nm的可見(jiàn)光區(qū)
紫外分光光度計(jì)：測(cè)量波長(zhǎng)范圍為200~400 nm的紫外區(qū)
2.2 分光光度計(jì)的工作原理
人眼可見(jiàn)的光只占電磁波譜（400~760nm）的一小部分
它是一種頻率較大的電磁波。電磁波是根據(jù)頻率，從頻率*小的無(wú)線電波到頻率*大的γ-射線排列成一排，即電磁波的頻譜，如下圖所示。
2.2.1 分光光度計(jì)的光譜范圍
包括波長(zhǎng)范圍為400~760 nm的可見(jiàn)光區(qū)和波長(zhǎng)范圍為200~400 nm的紫外光 不同的光源有其獨(dú)特的發(fā)射光譜，因此可以使用不同的發(fā)光體作為儀器的光源.
鎢燈發(fā)射光譜：鎢燈光源發(fā)出的400～760nm波長(zhǎng)的光譜，光線經(jīng)棱鏡折射后，由紅、橙、黃、綠、藍(lán)、靛、紫組成的連續(xù)色譜圖可以獲得;該色譜圖可作為可見(jiàn)光分光光度計(jì)的光源。
氫燈發(fā)射光譜：氫燈可發(fā)射185～400 nm波長(zhǎng)光譜，可作為紫外光度計(jì)的光源。
2.2.2 物質(zhì)的吸收光譜(1)
如果將某種物質(zhì)的溶液放在光源和棱鏡之間，此時(shí)屏幕上顯示的光譜就不再是光源的光譜了。它有幾條暗線，就是光中某些波長(zhǎng)的光被溶液吸收后的光譜稱(chēng)為溶液的吸收光譜。
不同物質(zhì)的吸收光譜是不同的。因此，根據(jù)吸收光譜，可以識(shí)別溶液中所含的物質(zhì)。
2.2.2 物質(zhì)的吸收光譜(2)\ n 當(dāng)光通過(guò)某種物質(zhì)的溶液時(shí)，透射光的強(qiáng)度減弱。由于部分光在溶液表面發(fā)生反射或散射，部分光被構(gòu)成溶液的物質(zhì)吸收，只有部分光能通過(guò)溶液。
入射光=反射光+散射光+吸收光+透射光
如果我們用蒸餾水（或構(gòu)成此溶液的溶劑）作為“空白”來(lái)校正由于反射、色散等因素造成的入射光損失，則：
入射光 = 吸收光 + 透射光
2.2.3 物質(zhì)的吸光度（A）與透射率（T）的關(guān)系
令I(lǐng)0為空白校正后的入射光強(qiáng)度； I 是透射光的強(qiáng)度。
根據(jù)實(shí)驗(yàn)，I = I0 ?10-εc l
式中，c表示吸波材料的摩爾濃度； l 表示吸波材料的光路，單位為cm； ε表示吸光材料的摩爾消光系數(shù)，表示物質(zhì)的光吸收特性。不同的物質(zhì)有不同的ε值。所以 I / I0 = 10-εc l
令 T（透射率）= I / I 0 T = 10-εcl
如果用 T 為吸波材料繪制濃度，則得到圖 1-5-2 中的曲線。
由上式可知，1g(1/T) = εc l
lg(l/T) 是物質(zhì)的吸光度 (A) A = 1g (1/T)
2.2.4 朗伯-比爾定律（E = εc l）
上式表明，物質(zhì)的吸光度與吸收物質(zhì)的濃度和液層厚度成正比。這就是光吸收的基本定律——蘭伯特-比爾（Lambert-Beer）定律。
2.3 分光光度計(jì)基本結(jié)構(gòu)
無(wú)論是哪種類(lèi)型的分光光度計(jì)，它都包括：光源、單色器、吸收池、檢測(cè)器和測(cè)量?jī)x器。光度計(jì)各部件排列順序如圖：
5個(gè)基本部分
分光光度計(jì)基本部件（一）：
光源：分光光度計(jì)上常用的光源有兩種：鎢絲燈或氫燈，在可見(jiàn)光區(qū)、近紫外光區(qū)和近紅外光區(qū)，常用鎢絲燈作為光源；在紫外光領(lǐng)域，多采用氫弧燈。
單色器：劃分混合光解析為單波長(zhǎng)光的裝置。它通常用作分光光度計(jì)中的色散元件。
Absorption cell cuvette, cuvette, cuvette) 一般由玻璃、石英或熔融石英制成，用于盛裝待測(cè)溶液。在 350 nm 以下的紫外區(qū)工作時(shí)，必須使用石英池或熔融石英池。
分光光度計(jì)的基本組成（二）：
吸收池（比色皿）必須是 光束方向是垂直的。此外，每組比色皿的厚度應(yīng)完全相同，以免出現(xiàn)錯(cuò)誤。比色皿壁上的指紋、油漬或沉積物會(huì)顯著影響其透光率，因此在使用前務(wù)必徹底清潔它們。
常用的光電池有光電管和光電倍增管三種。
測(cè)量裝置——常用的紫外和可見(jiàn)光分光光度計(jì)有三種測(cè)量裝置，即電流表、記錄儀和數(shù)字讀數(shù)單元現(xiàn)代儀器往往配備有自動(dòng)記錄儀，可以自動(dòng)跟蹤吸收曲線。
探測(cè)器
棱鏡和光柵
棱鏡：光波通過(guò)棱鏡時(shí)，不同波長(zhǎng)的光的折射率不同；因此，不同波長(zhǎng)的光可以分開(kāi)。玻璃對(duì)紫外光有很強(qiáng)的吸收作用，所以玻璃棱鏡多用于可見(jiàn)光分光光度計(jì)。石英棱鏡可以將光傳播到整個(gè)紫外光區(qū)域，因此被廣泛應(yīng)用于紫外光分光光度計(jì)中。
衍射光柵：在石英或玻璃表面雕刻出許多平行線（每英寸約15 000-30 000條）。由于劃線是不透明的，光的干涉和衍射使較長(zhǎng)的光波偏轉(zhuǎn)角變大，而較短的光波偏轉(zhuǎn)角小，從而形成光譜。
棱鏡單色儀裝置示意圖
光源在照射棱鏡（或光柵）之前，必須先通過(guò)一個(gè)入射狹縫，然后用平行光鏡使平行光束投射到棱鏡上，通過(guò)棱鏡的光再通過(guò)另一個(gè)聚光鏡，在聚光鏡的焦平面上可以獲得清晰的光譜。例如，將發(fā)射狹縫置于焦線上，通過(guò)旋轉(zhuǎn)棱鏡移動(dòng)光譜，就可以從發(fā)射狹縫發(fā)出所需的單色光。整個(gè)設(shè)備被稱(chēng)為“單色儀”
探測(cè)器---光電管
光電管安裝在一個(gè)特殊的盒子中，由三層物質(zhì)組成的圓形或矩形片組成。**層 是一種導(dǎo)電性好的金屬，是光伏電池的負(fù)極。中間很薄的一層是半導(dǎo)體硒，第三層是鐵，是光伏電池的正極。當(dāng)光伏電池受到光照射時(shí)，半導(dǎo)體硒表面會(huì)逸出電子。 ，這些電子只往負(fù)極的方向移動(dòng)，而不是正極，所以上下金屬片之間會(huì)產(chǎn)生電流。位置差，連接線時(shí)會(huì)產(chǎn)生電流
探測(cè)器---光電管
光電管 光電管由封裝在真空透明外殼中的半圓柱形陰極和絲陽(yáng)極組成。陰極上有凹圖。一層光發(fā)射材料，這種物質(zhì)在被光照射時(shí)可以發(fā)射電子。當(dāng)在兩個(gè)電極之間施加電位時(shí)，發(fā)射的電子流向絲陽(yáng)極以產(chǎn)生光電流。對(duì)于相同的輻射強(qiáng)度，它產(chǎn)生的電流大約是光電池產(chǎn)生的電流的1/4。由于光電管電阻大，產(chǎn)生的電流容易放大。
檢測(cè)器---光電倍增管
光電倍增管優(yōu)于普通光電管。將首 次發(fā)射的電子數(shù)放大到數(shù)百萬(wàn)倍。當(dāng)電子撞擊兼性陽(yáng)極時(shí)，會(huì)導(dǎo)致更多的電子從表面彈出。這些射出的電子被第 二個(gè)兼性陽(yáng)極吸引。 , 它還產(chǎn)生更多的電子。
這個(gè)過(guò)程重復(fù) 9 次后，每個(gè)光子可以形成 106 到 107 個(gè)電子。這些電子*終被收集在陽(yáng)極上。得到的倍增器電流可以進(jìn)一步放大和測(cè)量。
[$頁(yè)$]
2.4 分光光度法測(cè)量誤差
分光光度法測(cè)量誤差
選擇合適波長(zhǎng)的入射光
控制吸光度范圍A
選擇合適的參考溶液
儀器測(cè)量
測(cè)量誤差
測(cè)量條
項(xiàng)目選擇
2.4.1 儀器測(cè)量誤差
根據(jù)朗伯-比爾定律，可以知道只有在一定的濃度范圍內(nèi)，即在一定的吸光度范圍內(nèi)，由光譜光度計(jì)測(cè)量引起的測(cè)量結(jié)果的相對(duì)誤差較小；當(dāng)透光率接近0或1.0時(shí)，相對(duì)誤差趨于無(wú)窮大；一般透光率百分比在10%～80%之間（即吸光度在1～0.1之間），濃度測(cè)量的相對(duì)誤差較??；對(duì)于高精度儀器，當(dāng)吸光度A=0.7-0.2（透光率百分比約為20-60%）時(shí)，測(cè)量誤差約為1%。
2.4.2 測(cè)量條件的選擇
(1)選擇合適波長(zhǎng)的入射光：由于有色物質(zhì)選擇性吸收光，為了使測(cè)量結(jié)果更靈敏，必須選擇溶液*大吸收波長(zhǎng)的入射光。
(2)控制吸光度A的準(zhǔn)確讀數(shù)范圍：根據(jù)朗伯-比爾定律，吸光度僅控制在0.2~0.7讀數(shù)范圍內(nèi)，測(cè)量的準(zhǔn)確度更高。
(3)選擇參考溶液：參考溶液用于調(diào)整儀器的工作零點(diǎn)。蒸餾水無(wú)色可作為樣品溶液、試劑、顯色劑的參比溶液；否則，應(yīng)使用不含顯色劑的樣品溶液作為參比溶液。
一、分光光度法的定義及應(yīng)用
1.1 定義：分光光度法是利用物質(zhì)特有的吸收光譜來(lái)鑒別物質(zhì)或測(cè)定其含量的分析檢測(cè)技術(shù)。1.2 特點(diǎn)：靈敏、準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便，在復(fù)雜的組分體系中，無(wú)需分離，即可以檢測(cè)其中所含的極少量物質(zhì)。
1.3 應(yīng)用：生物<>化學(xué)研究中廣泛使用的方法之一，廣泛應(yīng)用于糖類(lèi)、蛋白質(zhì)、核酸、酶類(lèi)等的快速定量檢測(cè)。
二、分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)和工作原理
2.1 分光光度計(jì)的分類(lèi)
2.2 分光光度計(jì)工作原理
2.3 分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)\ n2.4 分光光度計(jì)的測(cè)量誤差
2.5 顯色反應(yīng)及其影響因素
2.1 分光光度計(jì)的分類(lèi)
分光光度計(jì)的分類(lèi)
紅外分光光度計(jì)：測(cè)量波長(zhǎng)范圍大于 760 nm 紅外光區(qū)
可見(jiàn)分光光度計(jì)：測(cè)量波長(zhǎng)范圍為400~760 nm的可見(jiàn)光區(qū)
紫外分光光度計(jì)：測(cè)量波長(zhǎng)范圍為200~400 nm的紫外區(qū)
2.2 分光光度計(jì)的工作原理
人眼可見(jiàn)的光只占電磁波譜（400~760nm）的一小部分
它是一種頻率較大的電磁波。電磁波是根據(jù)頻率，從頻率*小的無(wú)線電波到頻率*大的γ-射線排列成一排，即電磁波的頻譜，如下圖所示。
2.2.1 分光光度計(jì)的光譜范圍
包括波長(zhǎng)范圍為400~760 nm的可見(jiàn)光區(qū)和波長(zhǎng)范圍為200~400 nm的紫外光 不同的光源有其獨(dú)特的發(fā)射光譜，因此可以使用不同的發(fā)光體作為儀器的光源.
鎢燈發(fā)射光譜：鎢燈光源發(fā)出的400～760nm波長(zhǎng)的光譜，光線經(jīng)棱鏡折射后，由紅、橙、黃、綠、藍(lán)、靛、紫組成的連續(xù)色譜圖可以獲得;該色譜圖可作為可見(jiàn)光分光光度計(jì)的光源。
氫燈發(fā)射光譜：氫燈可發(fā)射185～400 nm波長(zhǎng)光譜，可作為紫外光度計(jì)的光源。
2.2.2 物質(zhì)的吸收光譜(1)
如果將某種物質(zhì)的溶液放在光源和棱鏡之間，此時(shí)屏幕上顯示的光譜就不再是光源的光譜了。它有幾條暗線，就是光中某些波長(zhǎng)的光被溶液吸收后的光譜稱(chēng)為溶液的吸收光譜。
不同物質(zhì)的吸收光譜是不同的。因此，根據(jù)吸收光譜，可以識(shí)別溶液中所含的物質(zhì)。
2.2.2 物質(zhì)的吸收光譜(2)\ n 當(dāng)光通過(guò)某種物質(zhì)的溶液時(shí)，透射光的強(qiáng)度減弱。由于部分光在溶液表面發(fā)生反射或散射，部分光被構(gòu)成溶液的物質(zhì)吸收，只有部分光能通過(guò)溶液。
入射光=反射光+散射光+吸收光+透射光
如果我們用蒸餾水（或構(gòu)成此溶液的溶劑）作為“空白”來(lái)校正由于反射、色散等因素造成的入射光損失，則：
入射光 = 吸收光 + 透射光
2.2.3 物質(zhì)的吸光度（A）與透射率（T）的關(guān)系
令I(lǐng)0為空白校正后的入射光強(qiáng)度； I 是透射光的強(qiáng)度。
根據(jù)實(shí)驗(yàn)，I = I0 ?10-εc l
式中，c表示吸波材料的摩爾濃度； l 表示吸波材料的光路，單位為cm； ε表示吸光材料的摩爾消光系數(shù)，表示物質(zhì)的光吸收特性。不同的物質(zhì)有不同的ε值。所以 I / I0 = 10-εc l
令 T（透射率）= I / I 0 T = 10-εcl
如果用 T 為吸波材料繪制濃度，則得到圖 1-5-2 中的曲線。
由上式可知，1g(1/T) = εc l
lg(l/T) 是物質(zhì)的吸光度 (A) A = 1g (1/T)
2.2.4 朗伯-比爾定律（E = εc l）
上式表明，物質(zhì)的吸光度與吸收物質(zhì)的濃度和液層厚度成正比。這就是光吸收的基本定律——蘭伯特-比爾（Lambert-Beer）定律。
2.3 分光光度計(jì)基本結(jié)構(gòu)
無(wú)論是哪種類(lèi)型的分光光度計(jì)，它都包括：光源、單色器、吸收池、檢測(cè)器和測(cè)量?jī)x器。光度計(jì)各部件排列順序如圖：
5個(gè)基本部分
分光光度計(jì)基本部件（一）：
光源：分光光度計(jì)上常用的光源有兩種：鎢絲燈或氫燈，在可見(jiàn)光區(qū)、近紫外光區(qū)和近紅外光區(qū)，常用鎢絲燈作為光源；在紫外光領(lǐng)域，多采用氫弧燈。
單色器：劃分混合光解析為單波長(zhǎng)光的裝置。它通常用作分光光度計(jì)中的色散元件。
Absorption cell cuvette, cuvette, cuvette) 一般由玻璃、石英或熔融石英制成，用于盛裝待測(cè)溶液。在 350 nm 以下的紫外區(qū)工作時(shí)，必須使用石英池或熔融石英池。
分光光度計(jì)的基本組成（二）：
吸收池（比色皿）必須是 光束方向是垂直的。此外，每組比色皿的厚度應(yīng)完全相同，以免出現(xiàn)錯(cuò)誤。比色皿壁上的指紋、油漬或沉積物會(huì)顯著影響其透光率，因此在使用前務(wù)必徹底清潔它們。
常用的光電池有光電管和光電倍增管三種。
測(cè)量裝置——常用的紫外和可見(jiàn)光分光光度計(jì)有三種測(cè)量裝置，即電流表、記錄儀和數(shù)字讀數(shù)單元現(xiàn)代儀器往往配備有自動(dòng)記錄儀，可以自動(dòng)跟蹤吸收曲線。
探測(cè)器
棱鏡和光柵
棱鏡：光波通過(guò)棱鏡時(shí)，不同波長(zhǎng)的光的折射率不同；因此，不同波長(zhǎng)的光可以分開(kāi)。玻璃對(duì)紫外光有很強(qiáng)的吸收作用，所以玻璃棱鏡多用于可見(jiàn)光分光光度計(jì)。石英棱鏡可以將光傳播到整個(gè)紫外光區(qū)域，因此被廣泛應(yīng)用于紫外光分光光度計(jì)中。
衍射光柵：在石英或玻璃表面雕刻出許多平行線（每英寸約15 000-30 000條）。由于劃線是不透明的，光的干涉和衍射使較長(zhǎng)的光波偏轉(zhuǎn)角變大，而較短的光波偏轉(zhuǎn)角小，從而形成光譜。
棱鏡單色儀裝置示意圖
光源在照射棱鏡（或光柵）之前，必須先通過(guò)一個(gè)入射狹縫，然后用平行光鏡使平行光束投射到棱鏡上，通過(guò)棱鏡的光再通過(guò)另一個(gè)聚光鏡，在聚光鏡的焦平面上可以獲得清晰的光譜。例如，將發(fā)射狹縫置于焦線上，通過(guò)旋轉(zhuǎn)棱鏡移動(dòng)光譜，就可以從發(fā)射狹縫發(fā)出所需的單色光。整個(gè)設(shè)備被稱(chēng)為“單色儀”
探測(cè)器---光電管
光電管安裝在一個(gè)特殊的盒子中，由三層物質(zhì)組成的圓形或矩形片組成。**層 是一種導(dǎo)電性好的金屬，是光伏電池的負(fù)極。中間很薄的一層是半導(dǎo)體硒，第三層是鐵，是光伏電池的正極。當(dāng)光伏電池受到光照射時(shí)，半導(dǎo)體硒表面會(huì)逸出電子。 ，這些電子只往負(fù)極的方向移動(dòng)，而不是正極，所以上下金屬片之間會(huì)產(chǎn)生電流。位置差，連接線時(shí)會(huì)產(chǎn)生電流
探測(cè)器---光電管
光電管 光電管由封裝在真空透明外殼中的半圓柱形陰極和絲陽(yáng)極組成。陰極上有凹圖。一層光發(fā)射材料，這種物質(zhì)在被光照射時(shí)可以發(fā)射電子。當(dāng)在兩個(gè)電極之間施加電位時(shí)，發(fā)射的電子流向絲陽(yáng)極以產(chǎn)生光電流。對(duì)于相同的輻射強(qiáng)度，它產(chǎn)生的電流大約是光電池產(chǎn)生的電流的1/4。由于光電管電阻大，產(chǎn)生的電流容易放大。
檢測(cè)器---光電倍增管
光電倍增管優(yōu)于普通光電管。將首 次發(fā)射的電子數(shù)放大到數(shù)百萬(wàn)倍。當(dāng)電子撞擊兼性陽(yáng)極時(shí)，會(huì)導(dǎo)致更多的電子從表面彈出。這些射出的電子被第 二個(gè)兼性陽(yáng)極吸引。 , 它還產(chǎn)生更多的電子。
這個(gè)過(guò)程重復(fù) 9 次后，每個(gè)光子可以形成 106 到 107 個(gè)電子。這些電子*終被收集在陽(yáng)極上。得到的倍增器電流可以進(jìn)一步放大和測(cè)量。
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2.4 分光光度法測(cè)量誤差
分光光度法測(cè)量誤差
選擇合適波長(zhǎng)的入射光
控制吸光度范圍A
選擇合適的參考溶液
儀器測(cè)量
測(cè)量誤差
測(cè)量條
項(xiàng)目選擇
2.4.1 儀器測(cè)量誤差
根據(jù)朗伯-比爾定律，可以知道只有在一定的濃度范圍內(nèi)，即在一定的吸光度范圍內(nèi)，由光譜光度計(jì)測(cè)量引起的測(cè)量結(jié)果的相對(duì)誤差較小；當(dāng)透光率接近0或1.0時(shí)，相對(duì)誤差趨于無(wú)窮大；一般透光率百分比在10%～80%之間（即吸光度在1～0.1之間），濃度測(cè)量的相對(duì)誤差較??；對(duì)于高精度儀器，當(dāng)吸光度A=0.7-0.2（透光率百分比約為20-60%）時(shí)，測(cè)量誤差約為1%。
2.4.2 測(cè)量條件的選擇
(1)選擇合適波長(zhǎng)的入射光：由于有色物質(zhì)選擇性吸收光，為了使測(cè)量結(jié)果更靈敏，必須選擇溶液*大吸收波長(zhǎng)的入射光。
(2)控制吸光度A的準(zhǔn)確讀數(shù)范圍：根據(jù)朗伯-比爾定律，吸光度僅控制在0.2~0.7讀數(shù)范圍內(nèi)，測(cè)量的準(zhǔn)確度更高。
(3)選擇參考溶液：參考溶液用于調(diào)整儀器的工作零點(diǎn)。蒸餾水無(wú)色可作為樣品溶液、試劑、顯色劑的參比溶液；否則，應(yīng)使用不含顯色劑的樣品溶液作為參比溶液。