產(chǎn)品組成：

　　產(chǎn)品簡介：

　　 活性氧檢測試劑盒(Reactive Oxygen Species Assay Kit)是一種利用熒光探針DCFH-DA 進(jìn)行活性氧檢

　　測的試劑盒。DCFH-DA 本身沒有熒光，可以自由穿過細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后，可以被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解

　　生成DCFH。而DCFH 不能通透細(xì)胞膜，從而使探針很容易被裝載到細(xì)胞內(nèi)。細(xì)胞內(nèi)的活性氧可以氧化無

　　熒光的DCFH 生成有熒光的DCF。檢測DCF 的熒光就可以知道細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平。

　　 本試劑盒提供了活性氧陽性對照試劑Rosup，以便于活性氧的檢測。Rosup 是一種混合物，濃度為

　　50mg/mL。

　　 本試劑盒本底低，靈敏度高，線性范圍寬，使用方便。

　　 本試劑盒可以測定100～500 個樣品。

　　使用說明：

　　1. 裝載探針

　　 對于刺激時間較短(通常為2小時以內(nèi))的細(xì)胞，先裝載探針，后用活性氧陽性對照或自己感興趣的

　　**刺激細(xì)胞。對于細(xì)胞刺激時間較長(通常為6小時以上)的細(xì)胞，先用活性氧陽性對照或自己感興趣

　　的**刺激細(xì)胞，后裝載探針。

　　 原位裝載探針：本方法僅適用于貼壁培養(yǎng)細(xì)胞。按照1∶1000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使終濃

　　度為10μmol/L。去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入適當(dāng)體積稀釋好的DCFH-DA。加入的體積以能充分蓋住細(xì)胞為宜，

　　通常對于六孔板的一個孔加入稀釋好的DCFH-DA不少于1mL。37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20分鐘。用無血清細(xì)

　　胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞三次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。通?；钚匝蹶栃詫φ赵诖碳ぜ?xì)胞20～30

　　分鐘后可以顯著提高活性氧水平。

　　 收集細(xì)胞后裝載探針：按照1∶1000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10μmol/L。細(xì)胞收集

　　后懸浮于稀釋好的DCFH-DA中，細(xì)胞濃度為一百萬至二千萬/mL，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20分鐘。每隔3～

　　5分鐘顛倒混勻一下，使探針和細(xì)胞充分接觸。用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞三次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)

　　胞內(nèi)的DCFH-DA。直接用活性氧陽性對照或自己感興趣的**刺激細(xì)胞，或把細(xì)胞等分成若干份后刺激

　　細(xì)胞。通?；钚匝蹶栃詫φ赵诖碳ぜ?xì)胞20～30分鐘后可以顯著提高活性氧水平。

　　說明：僅在陽性對照孔中加入Rosup作為陽性對照，其余孔不必加入Rosup。

　　2. 檢測

　　 對于原位裝載探針的樣品可以用激光共聚焦顯微鏡直接觀察，或收集細(xì)胞后用熒光分光光度計、熒光

　　酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀檢測。對于收集細(xì)胞后裝載探針的樣品可以用熒光分光光度計、熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)

　　胞儀檢測，也可以用激光共聚焦顯微鏡直接觀察。

　　3. 參數(shù)設(shè)置

　　 使用488nm激發(fā)波長，525nm發(fā)射波長，實時或逐時間點檢測刺激前后熒光的強(qiáng)弱。DCF的熒光光譜

　　和FITC非常相似，可以用FITC的參數(shù)設(shè)置檢測DCF。DCF的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜參考下圖。

　　4. 其它說明

　　 陽性對照可以按照1∶1000的比例使用。例如裝載好探針的細(xì)胞共1mL，可以加入1μL的陽性對照刺激。

　　通常刺激后20～30分鐘內(nèi)可以觀察到非常顯著的活性氧水平升高。對于不同的細(xì)胞，活性氧陽性對照的效

　　果可能有較大的差別。如果在刺激后30分鐘內(nèi)觀察不到活性氧的升高，可以適當(dāng)提高活性氧陽性對照的濃

　　度。如果活性氧升高得過快，可以適當(dāng)降低活性氧陽性對照的濃度。

　　 另外，對于某些細(xì)胞，如果發(fā)現(xiàn)沒有刺激的陰性對照細(xì)胞熒光也比較強(qiáng)，可以按照1∶2000～1∶5000

　　稀釋DCFH-DA，使裝載探針時DCFH-DA的濃度為2～5μmol/L。探針裝載的時間也可以根據(jù)情況在15～60

　　分鐘內(nèi)適當(dāng)進(jìn)行調(diào)整。

　　 活性氧陽性對照(Rosup)僅僅用于作為陽性對照的樣品，并不是在每個樣品中都需加入活性氧陽性

　　對照。

　　保存條件：

　　-20℃避光保存，有效期一年。

　　注意事項：

　　1. 探針裝載后，一定要洗凈殘余的未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的探針，否則會導(dǎo)致背景較高。

　　2. 探針裝載完畢并洗凈殘余探針后，可以進(jìn)行激發(fā)波長的掃描和發(fā)射波長的掃描，以確認(rèn)探針的裝載情

　　況是否良好。DCF的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜請參考上圖。

　　3. 盡量縮短探針裝載后到測定所用的時間(刺激時間除外)，以減少各種可能的誤差。

　　4. 為了您的**和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。