測(cè)定食物中的胱氨酸使用過(guò)甲酸氧化-氨基酸自動(dòng)分析儀法，測(cè)定色氨酸使用熒光分光光度法，測(cè)定其它氨基酸使用氨基酸自動(dòng)分析儀法。
一、氨基酸自動(dòng)分析儀法
1.原理
食物蛋白質(zhì)經(jīng)鹽酸水解成為游離氨基酸，經(jīng)氨基酸分析儀的離子交換柱分離后，與茚三酮溶液產(chǎn)生顏色反應(yīng)，再通過(guò)分光光度計(jì)比色測(cè)定氨基酸含量。一份水解液可同時(shí)測(cè)定天冬，蘇，絲，谷，脯，甘，丙，纈，蛋，異亮，亮，酪，苯丙，組，賴(lài)和精氨酸等16種氨基酸，其*低檢出限為10pmol。
2.適用范圍
GB/T14965-1994食物中氨基酸的測(cè)定方法。
本法適用于食物中的16種氨基酸的測(cè)定。其*低檢出限為10pmol。本方法不適用于蛋白質(zhì)含量低的水果、蔬菜、飲料和淀粉類(lèi)食物的測(cè)定
3.儀器和設(shè)備
3.1真空泵
3.2恒溫干燥箱
3.3水解管：耐壓螺蓋玻璃管或硬質(zhì)玻璃管，體積20～30ml。用去離子水沖洗干凈并烘干。
3.4真空干燥器(溫度可調(diào)節(jié))
3.5氨基酸自動(dòng)分析儀。
4.試劑
全部試劑除注明外均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。
4.1濃鹽酸：優(yōu)級(jí)純
4.26mol/L鹽酸：濃鹽酸與水1：1混合而成。
4.3苯酚：需重蒸餾。
4.4混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液(儀器制造公司出售)：0.0025mol/L
4.5緩沖液：
4.5.1pH2.2的檸檬酸鈉緩沖液：稱(chēng)取19.6g檸檬酸鈉(Na3C6H5O7.2H2O)和16.5ml濃鹽酸加水稀釋到1000ml，用濃鹽酸或50%的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至2.2
4.5.2pH3.3的檸檬酸鈉緩沖液：稱(chēng)取19.6g檸檬酸鈉和12ml濃鹽酸加水稀釋到1000ml，用濃鹽酸或50%的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至pH至3.3。
4.5.3pH4.0的檸檬酸鈉緩沖液：稱(chēng)取19.6g檸檬酸鈉和9ml濃鹽酸加水稀釋到1000ml，用濃鹽酸或50%的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至4.0。
4.5.4pH6.4的檸檬酸鈉緩沖液：稱(chēng)取19.6g檸檬酸鈉和46.8g氯化鈉(優(yōu)級(jí)純)加水稀釋到1000ml，用濃鹽酸或50%的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至6.4。
4.6茚三酮溶液
4.6.1pH5.2的乙酸鋰溶液：稱(chēng)取氫氧化鋰(LiOH.H2O)168g，加入冰乙酸(優(yōu)級(jí)純)279ml，加水稀釋到1000ml，用濃鹽酸或50%的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至5.2。
4.6.2茚三酮溶液：取150ml二甲基亞砜(C2H6OS)和乙酸鋰溶液(2.6.1)50ml加入4**合茚三酮(C9H4O3.H2O)和0.12g還原茚三酮(C18H10O6.2H2O)攪拌至完全溶解。
4.7高純氮?dú)猓杭兌?9.99%。
4.8 冷凍劑：市售食鹽與冰按1：3混合
5.操作步驟
5.1樣品處理：樣品采集后用勻漿機(jī)打成勻漿(或者將樣品盡量粉碎)于低溫冰箱中冷凍保存，分析用時(shí)將其解凍后使用。
5.2稱(chēng)樣：準(zhǔn)確稱(chēng)取一定量樣品，**到0.0001g。均勻性好的樣品如奶粉等，使樣品蛋白質(zhì)含量在10～20mg范圍內(nèi);均勻性差的樣品如鮮肉等，為減少誤差可適當(dāng)增大稱(chēng)樣量，測(cè)定前再稀釋。將稱(chēng)好的樣品防于水解管中。
5.3水解：在水解管內(nèi)加6mol/L鹽酸10～15ml(視樣品蛋白質(zhì)含量而定)，含水量高的樣品(如牛奶)可加入等體積的濃鹽酸，加入新蒸餾的苯酚3～4滴，再將水解管放入冷凍劑中，冷凍3～5min，再接到真空泵的抽氣管上，抽真空(接近0psi)，然后充入高純氮?dú)?再抽真空充氮?dú)猓貜?fù)三次后，在充氮?dú)鉅顟B(tài)下封口或擰緊螺絲蓋將已封口的水解管放在110±1℃的恒溫干燥箱內(nèi)，水解22h后，取出冷卻。
打開(kāi)水解管，將水解液過(guò)濾后，用去離子水多次沖洗水解管，將水解液全部轉(zhuǎn)移到50ml容量瓶?jī)?nèi)，用去離子水定容。吸取濾液1ml于5ml容量瓶?jī)?nèi)，用真空干燥器在40～50℃干燥，殘留物用1～2ml水溶解，再干燥，反復(fù)進(jìn)行兩次，*后蒸干，用1mlpH2.2的緩沖液溶解，供儀器測(cè)定用。
5.4測(cè)定：準(zhǔn)確吸取0.200ml混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)，用pH2.2的緩沖液稀釋到5ml，此標(biāo)準(zhǔn)稀釋濃度為5.00nmol/50μL，作為上機(jī)測(cè)定用的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)，用氨基酸自動(dòng)分析儀以外標(biāo)法測(cè)定樣品測(cè)定液的氨基酸含量。
6.計(jì)算
上機(jī)樣品液(50mL)中氨基酸量(nmol)=
上機(jī)標(biāo)準(zhǔn)液(50mL)中氨基酸量(nmol)×樣品峰面積
氨基酸標(biāo)準(zhǔn)峰面積
所以，100g樣品中氨基酸的mg 數(shù)=
上機(jī)樣品液中氨基酸量(nmol)×f ×Mr×100
m×V×106
式中
f--樣品的稀釋倍數(shù)
Mr--氨基酸的相對(duì)分子量
m--樣品質(zhì)量(g)
V--上機(jī)時(shí)的進(jìn)樣量(此處為50mL)
7.其他
7.1測(cè)定條件(以Beckman-6300型氨基酸自動(dòng)分析儀為例)
緩沖液流量：20mL/h;
茚三酮流量：10mL/h;
柱溫：50、60和70℃;
色譜柱：20cm;
分析時(shí)間：42min。
7.2標(biāo)準(zhǔn)出峰順序和保留時(shí)間
序號(hào) 出峰順序 保留時(shí)間/min 序號(hào) 出峰順序 保留時(shí)間/min
1 天冬氨酸 5.55 9 蛋氨酸 19.63
2 蘇氨酸 6.60 10 異亮氨酸 21.24
3 絲氨酸 7.09 11 亮氨酸 22.06
4 谷氨酸 8.72 12 酪氨酸 24.52
5 脯氨酸 9.63 13 苯丙氨酸 25.76
6 甘氨酸 12.24 14 組氨酸 30.41
7 丙氨酸 13.10 15 賴(lài)氨酸 32.57
8 纈氨茇 16.65 16 精氨酸 40.75
7.3允許差： 同實(shí)驗(yàn)室平行測(cè)定或連續(xù)兩次測(cè)定結(jié)果相對(duì)偏差***≤12%。
二、食物中胱氨酸的測(cè)定方法---氨基酸自動(dòng)分析儀法(過(guò)甲酸氧化)
1.原理
在用鹽酸水解蛋白質(zhì)的過(guò)程中，胱氨酸易被破壞，現(xiàn)多采用過(guò)甲酸氧化法將蛋白質(zhì)中的胱氨酸及半胱氨酸氧化成半胱磺酸，其反應(yīng)如下：
SH NH2 O SO3H NH2 O
CH2 CH COOH+3H C OOH CH2 CH COOH+3H C OH
半胱氨酸 過(guò)甲酸 半胱磺酸 甲酸
生成的半胱磺酸可在氨基酸自動(dòng)分析儀上進(jìn)行測(cè)定，與標(biāo)準(zhǔn)半胱磺酸比較，計(jì)算其含量。
2.適用范圍
參照中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生研究所編寫(xiě)的食物營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定法第三版。適用于食物中胱氨酸的測(cè)定。
3.儀器
水解瓶：耐壓螺蓋玻璃管或硬質(zhì)試管，體積20～30mL，用去離子水沖凈并烘干，電熱減壓蒸發(fā)器。
4.試劑
過(guò)甲酸：取9mL分析純甲酸加入1mL30%過(guò)氧化氫混合，在室溫放置2小時(shí)以上。
5.操作步驟
5.1過(guò)甲酸氧化：稱(chēng)取一定量的食物樣品置于水解瓶中，使樣品含蛋白質(zhì)在5～10mg，加入1mL過(guò)甲酸試劑，在室溫放置3小時(shí)。加1mL乙醇終止氧化。將樣品瓶置于電熱減壓器中，于45℃減壓蒸干，用1mL去離子水淋洗瓶壁，再蒸干，反復(fù)3次，以除去過(guò)甲酸。
5.2鹽酸水解：同食物中氨基酸(16種)測(cè)定方法
5.3在Bekman6300氨基酸自動(dòng)分析儀上，在注文50℃時(shí)用pH3.25檸檬酸緩沖液洗脫，半胱磺酸的出峰時(shí)間約在1.78分鐘。
6.計(jì)算
上機(jī)樣品液(50μl)中半胱磺酸量=
上機(jī)標(biāo)準(zhǔn)液中半胱磺酸量(nmol)×樣品峰面積
半胱磺酸標(biāo)準(zhǔn)峰面積
100g樣品中胱氨酸mg數(shù)=
上機(jī)樣品中半胱磺酸量(nmol)×D×M×100
W×E×106×2
式中
D：樣品稀釋倍數(shù)
M：胱氨酸分子量(ng)
W：稱(chēng)樣量(g)
E：上機(jī)時(shí)的進(jìn)樣量(此處為50μl)
三、食物中色氨酸的測(cè)定--熒光分光光度法
1.原理
食物中蛋白質(zhì)在酸水解過(guò)程中，其色氨酸極易被分解，本法用堿水解蛋白質(zhì)，直接測(cè)定色氨酸的天然熒光。在蛋白質(zhì)水解液中，只有色氨酸和酪氨酸可以檢測(cè)到熒光。在pH為11時(shí)，色氨酸的熒光強(qiáng)度比酪氨酸大100倍，且兩種氨基酸的熒光峰相差40多nm，利用此特點(diǎn)，可在有大量酪氨酸的存在下，檢測(cè)色氨酸的含量。
2.適用范圍
參照中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生研究所編寫(xiě)的食物營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定法第三版。適用于食物中色氨酸的測(cè)定。
3.儀器
3.1熒光分光光度計(jì)
3.2減壓蒸發(fā)器
3.3螺旋蓋大口瓶(瓶蓋要有橡皮墊)
3.4聚四氟乙烯管
3.5小玻璃球
3.6烘箱
4.試劑
(1)5mol/L NaOH：內(nèi)含0.5%可溶性淀粉，臨用前配制。
(2)4mol/L 尿素(pH=11)
(3) 6mol/L鹽酸
(4) 溴百里酚藍(lán)指示劑：稱(chēng)取0.1g溴百里酚藍(lán)加0.1mol/L氫氧化鈉1.6ml，配成0.05%水溶液。
(5) 高純氮(含量99.999%)
(6) 辛醇甲苯溶液：內(nèi)含1%辛醇
(7) 色氨酸標(biāo)準(zhǔn)液：(1mg/ml)：稱(chēng)取色氨酸標(biāo)準(zhǔn)，用0.005mol/L的氫氧化鈉溶液溶解，貯存于冰箱保存。
5.操作步驟
5.1稱(chēng)取含粗蛋白質(zhì)約5mg的食物樣品，置于聚四氟乙烯管中，加含可溶性淀粉的5mol/L氫氧化鈉1ml，加入1滴辛醇。
5.2將各管分別蓋上小玻璃球，放入1只帶螺旋蓋的大口玻璃瓶中，將瓶置于減壓蒸發(fā)裝置中，加冰和鹽降溫，減壓至真空度1.3Kpa10mmHg以下，繼續(xù)保持15min，充氮?dú)庠贉p壓，如此反復(fù)3次，迅速旋緊大口瓶的螺旋蓋。
5.3將充氮?dú)獾拇罂谄恐糜诳鞠鋬?nèi)，在110℃水解樣品22小時(shí)。
5.4冷卻大口瓶，用重蒸餾水將樣品分別洗至25ml容量瓶中，(內(nèi)含6N Hcl0.7ml)用溴百里酚藍(lán)為指示劑調(diào)pH至中性，用重蒸水定容至刻度。
5.5吸取樣品液1ml，于10ml帶蓋試管內(nèi)，用pH11的4mol/L尿素溶液稀釋至刻度，在激發(fā)波長(zhǎng)為280nm，發(fā)射波長(zhǎng)為360mm下測(cè)定熒光強(qiáng)度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)色氨酸的熒光強(qiáng)度曲線(xiàn)，計(jì)算樣品中色氨酸含量。
5.6色氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：用前將標(biāo)準(zhǔn)貯備液稀釋成每ml含100，200，300，400μg的色氨酸標(biāo)準(zhǔn)系列。取每種濃度的標(biāo)準(zhǔn)液各1ml(雙份)與樣品管同樣加試劑，同時(shí)水解，以色氨酸標(biāo)準(zhǔn)濃度為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。
6.計(jì)算
每100g樣品中的色氨酸含量(mg)=A×D×100
1000×W
式中
A：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)得到的每ml測(cè)定液中色氨酸的含量(mg)
D： 稀釋倍數(shù)
W： 取樣量(克)
食物中氨基酸的測(cè)定方法
公安機(jī)關(guān)備案號(hào)：
