抗體標(biāo)記與檢測(cè)指南

對(duì)于初次接觸抗體標(biāo)記的新手而言，面對(duì)文獻(xiàn)中發(fā)表的諸多標(biāo)記方法，難免產(chǎn)生困惑。到底這些標(biāo)記方法的關(guān)鍵點(diǎn)是什么？在具體情況下該采用何種標(biāo)記方法？根據(jù)傳統(tǒng)的標(biāo)記方法，我們有必要對(duì)化學(xué)修飾的原理有一個(gè)基本的了解，因?yàn)榭贵w和/或標(biāo)記物在進(jìn)行標(biāo)記（結(jié)合）反應(yīng)前需要化學(xué)活化。

本指南是一個(gè)用戶友好的工具，可讓您學(xué)習(xí)了解常見抗體標(biāo)記方法的基本知識(shí)。同時(shí)還介紹了 Lightning-Link抗體標(biāo)記技術(shù)，該技術(shù)極大簡(jiǎn)化了抗體標(biāo)記步驟，利用該技術(shù)標(biāo)記抗體不需要您具備太多化學(xué)方面的知識(shí)，并且標(biāo)記的手頭操作時(shí)間僅需短短的30秒！

抗體 與標(biāo)記物

抗體廣泛應(yīng)用于多種**分析中，用于檢測(cè)和定量抗原。直接識(shí)別抗原的抗體被稱為一抗（primary antibody），賦予檢測(cè)的特異性。同時(shí)，在檢測(cè)中還需加入標(biāo)記物（詳見后文“間接標(biāo)記法 Vs.直接標(biāo)記法”），標(biāo)記物的加入賦予可檢測(cè)性。表1中列出了一些常用的**分析技術(shù)，及可能使用到的標(biāo)記物。

表1、**試驗(yàn)的類型及其相關(guān)檢測(cè)標(biāo)記物

直接檢測(cè)法 Vs.間接檢測(cè)法

檢測(cè)技術(shù)可分為兩大類：直接法和間接法。對(duì)于直接檢測(cè)法，標(biāo)記物通過(guò)共價(jià)鍵連接到一抗上。而對(duì)于間接檢測(cè)法，標(biāo)記物則是共價(jià)連接到與一抗特異性結(jié)合的二抗上。

在間接法中，檢測(cè)由兩個(gè)部分組成：**步，用未標(biāo)記的一抗進(jìn)行孵育（通常1小時(shí)），(若存在抗原)部分抗體與抗原結(jié)合，未結(jié)合的抗體則通過(guò)洗滌去掉，然后加入標(biāo)記二抗。再次孵育（通常1小時(shí)），洗滌去掉未結(jié)合的二抗。然后對(duì)結(jié)合在抗體上的標(biāo)記物進(jìn)行量化。若有抗原存在時(shí)，標(biāo)記物通常導(dǎo)致有色物質(zhì)的生成或某一個(gè)波長(zhǎng)的發(fā)射光量增加。當(dāng)無(wú)抗原存在時(shí)，則無(wú)一抗的結(jié)合，也無(wú)二抗試劑的結(jié)合，因此無(wú)信號(hào)產(chǎn)生。

在直接法中，標(biāo)記物直接與一抗共價(jià)結(jié)合，因此僅需一輪孵育及洗滌步驟，而間接法則需要兩輪孵育及洗滌步驟。直接法簡(jiǎn)化了試驗(yàn)的流程，但檢測(cè)的靈活性降低。下表2列舉出了直接法/間接法的主要利弊。

表2.直接法與間接法的利弊比較

盡管直接標(biāo)記法具有諸多潛在的優(yōu)點(diǎn)，但為何如今眾多的**分析仍采用間接法原理呢?

無(wú)疑，*主要的原因就是直接標(biāo)記一抗相對(duì)較復(fù)雜，確實(shí)從歷來(lái)經(jīng)驗(yàn)看，抗體標(biāo)記都是由那些具有化學(xué)修飾技術(shù)的專業(yè)人員來(lái)完成的。在間接法中二抗試劑所起的信號(hào)放大效應(yīng)究竟如何呢？是否直接標(biāo)記法所產(chǎn)生的信號(hào)就很弱？其實(shí)在很多情況下，間接法的放大效應(yīng)是讓人產(chǎn)生錯(cuò)覺的。在與二抗試劑的孵育過(guò)程及洗滌過(guò)程中，一些一抗會(huì)與抗原發(fā)生解離，因此真正被放大的只是逐漸減少的一抗的量。其實(shí)在很多情況下，直接法也可獲得與間接法相同甚至更好的結(jié)果。

抗體標(biāo)記方法

抗體和所有蛋白一樣，是由氨基酸殘基組成的。蛋白的氨基基團(tuán)（包括賴氨酸側(cè)鏈和氨基端）通常被用于共價(jià)鏈接標(biāo)記物。盡管在文獻(xiàn)中報(bào)道了多種多樣的標(biāo)記方法，但實(shí)際上只有4種*常用的標(biāo)記方法，且不同之處僅在于標(biāo)記物被轉(zhuǎn)換為反應(yīng)性衍生物的方式。無(wú)論何種方法，幾乎毫無(wú)例外的都是將標(biāo)記物共價(jià)連接到抗體分子的賴氨酸殘基上。

以下是4種*主要的抗體標(biāo)記法

1.琥珀酰酯 (NHS)

當(dāng)使用熒光染料標(biāo)記時(shí)，通常可購(gòu)買內(nèi)配有NHS琥珀酰酯(也稱為琥珀酰亞胺酯)的活化標(biāo)記物。在適當(dāng)條件下，活化的染料可與抗體分子反應(yīng)（抗體分子通常含有多了賴氨酸基團(tuán)）而形成結(jié)合物。過(guò)量的活性染料可通過(guò)多種方法去掉（通常采用過(guò)柱層析），然后標(biāo)記抗體可應(yīng)用于**分析。

當(dāng)標(biāo)記物為蛋白分子（如辣根過(guò)氧化物酶HRP、堿性磷酸酶AP或藻紅蛋白PE）時(shí)，由于抗體和標(biāo)記分子具有多個(gè)胺，因此抗體標(biāo)記流程略為復(fù)雜。在這種情況下，通常需要對(duì)其中一個(gè)分子（抗體）的一些賴氨酸進(jìn)行修飾，以此創(chuàng)造一個(gè)新的反應(yīng)基團(tuán)（X），而標(biāo)記物上的賴氨酸作為另一個(gè)反應(yīng)基團(tuán)（Y）。當(dāng)抗體與標(biāo)記物混合時(shí)，利用雙功能試劑引入Y基團(tuán)，隨之與X基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，從而形成異二聚體結(jié)合物（即標(biāo)記抗體）。關(guān)于雙功能試劑標(biāo)記抗體或其他生物分子的應(yīng)用，您可以在數(shù)百篇文獻(xiàn)報(bào)道中找到相關(guān)例子。

3.碳二亞胺（Carbodiimides）

這類試劑（EDC為常見的例子）在胺基和含羧基的分子間形成共價(jià)連接。Carbodiimides活化羧基，活化的中間體隨后被胺基（由抗體分子的賴氨酸提供）吸附。Carbodiimides通常用于連接抗體和羧化的顆粒（如乳膠顆粒、磁珠），以及其他羧化的表面如微孔板或芯片表面。Carbodiimides很少用于將染料或蛋白標(biāo)記物偶聯(lián)到抗體上。

4.高碘酸鈉（Sodium periodate）

這種化學(xué)物質(zhì)對(duì)于絕大多數(shù)的標(biāo)記物都是不適用的，但對(duì)于HRP標(biāo)記卻十分重要。高碘（Periodate）活化辣根過(guò)氧化物酶分子的糖鏈，從而形成醛基，后者可與抗體分子上的賴氨酸反應(yīng)。由于HRP分子本身含有非常少的賴氨酸，因而相對(duì)容易獲得抗體-HRP結(jié)合物，且無(wú)明顯的HRP多聚化發(fā)生。

拜力生物編輯整理：www.lookbio.com