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PCR擴(kuò)增制備帶標(biāo)記探針

實(shí)驗(yàn)步驟

1. 生物素標(biāo)記

應(yīng)用bio-11-dUTP部分替代dTTP攙入PCR擴(kuò)增探針中

   1) 配制反應(yīng)體系

dNTP的組成  dATP、dCTP、dGTP各20mmol，dTTP 15mmol，bio-11-dUTP 5mmol混勻，其他試劑如常規(guī)PCR。

   2) 25循環(huán)后，凍存，取出化凍，趁下層水相尚在冰凍狀態(tài)，吸盡石蠟油

   3) 水相中20mg/ml糖原1ul，pH5.2 2.5MnaAC10ul，220ul無水乙醇。混勻后－20℃過夜

   4) 離心取沉淀，冷凍干燥后100ul水或TE復(fù)溶。

2. 地高辛標(biāo)記

應(yīng)用dig-11-dUTP部分替代dTTP攙入PCR擴(kuò)增探針中

   1) 配制反應(yīng)體系

dNTP的組成  dATP、dCTP、dGTP各200umol，dTTP 130umol，bio-11-dUTP 70umol混勻，其他試劑如常規(guī)PCR。

   2) 35循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物

30 擴(kuò)增產(chǎn)物純化與DIG隨機(jī)標(biāo)記探針方法相同（僅沉淀時，50ulPCR反應(yīng)液中加入5ul4MliCl和150ul冰乙醇）。

注意事項(xiàng)

1. 標(biāo)記時標(biāo)記基團(tuán)在dNTP中占的比例不能太高，因標(biāo)記基團(tuán)與dTTP相比具位阻效應(yīng)，比例太高PCR擴(kuò)增及以后的雜交都要受到影響。

2. 靶DNA用量不能太高，生物素標(biāo)記中控制在0.2fmol左右；地高辛標(biāo)記中可低至0.1ng