一、原代細胞培養(yǎng)
(一)原理 細胞培養(yǎng)(Cell culture)是模擬機體內(nèi)生理條件，將細胞從機體中取出，在人工條件下使其生存、生長、繁殖和傳代，進行細胞生命過程、細胞癌變、細胞工程等問題的研究。近年來，廣泛地應(yīng)用于分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、**學(xué)、腫瘤學(xué)、細胞工程等領(lǐng)域，發(fā)展成一種重要生物技術(shù)，并取得顯著成就。由體內(nèi)直接取出組織或細胞進行培養(yǎng)叫原代培養(yǎng)。原代培養(yǎng)細胞離體時間短，性狀與體內(nèi)相似，適用于研究。一般說來，幼稚狀態(tài)的組織和細胞，如：動物的胚胎、幼仔的臟器等更容易進行原代培養(yǎng)。
(二)操作 1．取材 用頸椎脫位法使乳兔迅速死亡。然后，把整個動物浸入盛有75％乙醇的燒杯中數(shù)秒鐘**，取出后放在大平皿中攜入超凈臺。用消過毒的剪刀剪開用碘酒和乙醇再次**后的皮膚，剖腹取出肝臟或腎臟。置于無菌平皿中。 2．切割 用**的PBS液將取出的臟器清洗三次，然后用眼科手術(shù)剪刀仔細將組織反復(fù)剪碎，直到成1mm3左右的小塊，再用PBS清洗，洗到組織塊發(fā)白為止。移入無菌離心管中，靜置數(shù)分鐘，使組織塊自然沉淀到管底，棄去上清。 3．消化、接種培養(yǎng) 吸取0.25％胰蛋白酶一0.02％EDTA混合消化液1ml，加入離心管中，與組織塊混勻后，加上管口塞子，37℃水浴中消化8～10分鐘，每隔幾分鐘搖動一下試管，使組織與消化液充分接觸，靜止，吸去上清，向離心管中加入5～10ml含5％小牛血清的MEM培養(yǎng)基，用吸管吹打混勻，移入二個培養(yǎng)瓶中，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
(三)結(jié)果 細胞接種后一般幾小時內(nèi)就能貼壁，并開始生長，如接種的細胞密度適宜，5天到一周即可形成單層。
二、傳代細胞培養(yǎng)
(一)原理 體外培養(yǎng)的原代細胞或細胞株要在體外持續(xù)地培養(yǎng)就必須傳代，以便獲得穩(wěn)定的細胞株或得到大量的同種細胞，并維持細胞種的延續(xù)。培養(yǎng)的細胞形成單層匯合以后，由于密度過大生存空間不足而引起營養(yǎng)枯竭，將培養(yǎng)的細胞分散，從容器中取出，以1:2或l:3以上的比率轉(zhuǎn)移到另外的容器中進行培養(yǎng)，即為傳代培養(yǎng)。 細胞“一代”指從細胞接種到分離再培養(yǎng)的一段期間，與細胞世代或倍增不同。在一代中，細胞培增3～6次。細胞傳代后，一般經(jīng)過三個階段：游離期、指數(shù)增生期和停止期。常用細胞分裂指數(shù)表示細胞增殖的旺盛程度，即細胞群的分裂相數(shù)／100個細胞。一般細胞分裂指數(shù)介于0.2％～0.5％，腫瘤細胞可達3～5％。細胞接種2～3天分裂增殖旺盛，是活力*好時期，稱指數(shù)增生期(對數(shù)生長期)，適宜進行各種試驗。
(二)操作 1．將長成單層的原代培養(yǎng)細胞或HeLa細胞從二氧化碳培養(yǎng)箱中取出，在超凈工作臺中倒掉瓶內(nèi)的培養(yǎng)液，加入少許消化液。(以液面蓋住細胞為宜)，靜置5～10分鐘。2.在倒置鏡下觀察被消化的細胞，如果細胞變園，相互之間不再連接成片，這時應(yīng)立即在超凈臺中將消化液倒掉，加入3～5ml新鮮培養(yǎng)液，吹打，制成細胞懸液。 3．將細胞懸液吸出2ml左右，加到另一個培養(yǎng)瓶中并向每個瓶中分別加3ml左右培養(yǎng)液，蓋好瓶塞，送回二氧化碳培養(yǎng)箱中，繼續(xù)進行培養(yǎng)。
(三)結(jié)果 一般情況，傳代后的細胞在2小時左右就能附著在培養(yǎng)瓶壁上，2～4天就可在瓶內(nèi)形成單層，需要再次進行傳代。
【器材及液體的準備和無菌操作的注意事項 】
(一)器材和液體的準備 細胞培養(yǎng)用的玻璃器材，如：培養(yǎng)瓶、吸管等在清洗干凈以后，裝在鋁盒和鐵筒中，120℃，2小時干烤**后備用；手術(shù)器材、瓶塞、配制好的PBS液用**鍋15磅，20分鐘蒸氣**；MEM培養(yǎng)液、小牛血清、消化液用G6濾器負壓抽濾后備用。
(二)無菌操作中的注意事項 在無菌操作中，一定要保持工作區(qū)的無菌清潔。為此，在操作前要認真地洗手并用75％乙醇**。操作前20～30分鐘起動超凈臺吹風(fēng)。操作時，嚴禁說話，嚴禁用手直接拿無菌的物品，如瓶塞等，而要用器械，如止血鉗、鑷子等去拿。培養(yǎng)瓶要在超凈臺內(nèi)才能打開瓶塞，打開之前用乙醇將瓶口**，打開后和加塞前瓶口都要在酒精燈上燒一下，打開瓶口后的操作全部都要在超凈臺內(nèi)完成。操作完畢后，加上瓶塞，才能拿到超凈臺外。使用的吸管在從**的鐵筒中取出后要手拿末端，將**在火上燒一下，戴上膠皮**，然后再去吸取液體?？傊?，在整個無菌操作過程中都應(yīng)該在酒精燈的周圍進行。
ATCC細胞 細胞凍存方法
ATCC細胞 細胞凍存方法
主要操作步驟為：
（1）選擇處于對數(shù)生長期的細胞，在凍存前***好換液。將多個培養(yǎng)瓶中的細胞培養(yǎng)液去掉，用0.25% 胰蛋白酶消化。適時去掉胰蛋白酶，加入少量新培養(yǎng)液。用吸管吸取培養(yǎng)液反復(fù)吹打瓶壁上的細胞，使其成為均勻分散的細胞懸液。懸浮生產(chǎn)細胞則不要消化處理。然后將細胞收集于離心管中離心（1000r/min，10分鐘）。
（2）去上清液，加入含20%小牛血清的完全培養(yǎng)基，于4℃預(yù)冷15分鐘后，逐滴加入已無菌的DMSO或甘油，用吸管輕輕吹打使細胞均勻，細胞濃度為3×106～1×107/mL之間。
（3）將上述細胞分裝于安瓿或?qū)Ｓ美鋬鏊芰瞎苤?，安瓿裝1～1.5mL在火焰噴燈上封口，封口處要完全封閉，圓滑無勾。冷凍管要將蓋子蓋緊，并標記好細胞名稱和凍存日期，同時作好登記（日期、細胞種類及代次、凍存支數(shù)）。
（4）將裝好細胞的安瓿或凍存管裝入沙布袋內(nèi)；置于液氮容器頸口處存放過夜，次日轉(zhuǎn)入液氮中。采用控制降溫速度的方法也可采用下列步驟：先將安瓿置入4℃冰箱中2～3小時，再移至冰箱冷凍室內(nèi)3～4小時（此步可省略），再吊入液氮容器頸氣態(tài)部分存放2小時，*后沉入液氮中。
細胞凍存在液氮中可以長期保存，但為妥善起見，凍存半年后，*好取出一只安瓿細胞復(fù)蘇培養(yǎng)，觀察生長情況，然后再繼續(xù)凍存。
細胞的復(fù)蘇
一、細胞復(fù)蘇的原則
在實際操作中，凍存細胞要進行復(fù)蘇，再培養(yǎng)傳代。復(fù)蘇細胞一般采用快速融化法。以保證細胞外結(jié)晶快速融化，以避免慢速融化水分滲入細胞內(nèi)，再次形成胞內(nèi)結(jié)晶損傷細胞。
二、細胞復(fù)蘇的主要操作步驟
(1)佩戴眼鏡和手套，從液氮罐中取出安瓿或冷凍管。
(2)迅速放入38℃水浴中，并不時搖動，在1分鐘內(nèi)使其完全融化，然后在無菌下取出細胞。
(3)在1000r/min速度下離心5～10分鐘，棄去上層液，加入適量培養(yǎng)液后接種于培養(yǎng)瓶中，接種濃度1×109/L，置37℃溫箱靜置培養(yǎng)，次日更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，觀察生長情況。若細胞密度較高，及時傳代?；驘o需離心直接將細胞加入瓶中，并加入培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)12～24小時后，充去上清，換入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
三、注意事項
在細胞復(fù)蘇操作時，應(yīng)注意融化凍存細胞速度要快，可不時搖動安瓿或冷凍管，使之盡快通過*易受損的溫度段(-5～0℃)。這樣復(fù)蘇的凍存細胞存活率高，生長及形態(tài)良好。然而，由于凍存的細胞還受其他因素的影響，有時也會有部分細胞死亡。此時，可將不貼壁、飄浮在培養(yǎng)液上(已死亡)的細胞輕輕倒掉，再補以適量的新培養(yǎng)液，也會獲得較為滿意的結(jié)果。
ATCC細胞的原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)、凍存和復(fù)蘇實驗方法步驟 http://www.lookbio.com/threestyle/lookbio/firstcatalog/2879568/1.html
ATCC細胞的原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)、凍存和復(fù)蘇實驗方法步驟 http://www.lookbio.com/threestyle/lookbio/firstcatalog/2879568/1.html
公安機關(guān)備案號：
