細(xì)胞培養(yǎng)基使用方法（微孔濾膜過(guò)濾**）
細(xì)胞培養(yǎng)基的種類(lèi)繁多，細(xì)胞培養(yǎng)方式也較多，如何正確地使用培養(yǎng)基及*大程度地保持培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)以維持細(xì)胞的生長(zhǎng)，對(duì)每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)工作者都很重要。培養(yǎng)基的使用依據(jù)不同的培養(yǎng)基種類(lèi)、培養(yǎng)方式、細(xì)胞種類(lèi)的不同而存在差異。
1、細(xì)胞培養(yǎng)液的構(gòu)成
細(xì)胞培養(yǎng)液指細(xì)胞生長(zhǎng)的液體環(huán)境，一般指完全培養(yǎng)液，添加了血清、水解乳蛋白、各種添加劑等可以直接使用的培養(yǎng)液。
1.1 細(xì)胞培養(yǎng)基&血清模式
血清對(duì)于在傳統(tǒng)培養(yǎng)基配方中生長(zhǎng)和增殖的大多數(shù)細(xì)胞系來(lái)說(shuō)是需要的，因?yàn)榇蠖鄶?shù)單獨(dú)的培養(yǎng)基并不能提供細(xì)胞生長(zhǎng)所需要的全部營(yíng)養(yǎng)，如MEM培養(yǎng)基，較為常用的量為5%～10%的比例，而特殊的低血清培養(yǎng)基血清量可降至3%左右，細(xì)胞的形態(tài)和功能不受影響。
圖1 BHK21-13第14代，MEM SLM培養(yǎng)基(SLM120)+3%NBS，100×
注：SLM120為清大天一公司低血清培養(yǎng)基，上圖為培養(yǎng)24小時(shí)細(xì)胞密度，下圖為48小時(shí)細(xì)胞密度。
血清可在培養(yǎng)基**后加入，也可與培養(yǎng)基混合后一起過(guò)濾。血清的添加一方面補(bǔ)充了細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖所需的一些因子(如生長(zhǎng)因子等)，另一方面也增加了培養(yǎng)基的黏滯度，這樣可以降低細(xì)胞在懸浮培養(yǎng)中或被胰蛋白酶消化后的損傷。
但是血清的加入也帶來(lái)了很多問(wèn)題，血清都是批量生產(chǎn)，各批之間差異很大，血清含一些對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性的物質(zhì)，如多胺氧化酶、補(bǔ)體、抗體、****等都會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)，甚至造成細(xì)胞死亡。血清的使用使得實(shí)驗(yàn)和生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)化困難，其中的蛋白質(zhì)使得某些轉(zhuǎn)基因蛋白生物藥品生產(chǎn)中分離純化工作很難完成。血清質(zhì)量問(wèn)題還會(huì)對(duì)接種病毒以及毒價(jià)產(chǎn)生影響，例產(chǎn)毒少，毒價(jià)低。
1.2 細(xì)胞培養(yǎng)基&乳歐液模式
化學(xué)合成培養(yǎng)基現(xiàn)雖已大規(guī)模使用，但在某些培養(yǎng)領(lǐng)域水解乳蛋白(Lactalbumin Hydrolysate )仍在使用，以補(bǔ)充培養(yǎng)液中缺乏的氨基酸、小肽物質(zhì)。較為常用的方式是用漢氏(Hank's BSS)或歐式(Earle's BSS)平衡鹽溶液溶解水解乳蛋白(一般為5‰濃度)，即成乳漢(歐)液，再與化學(xué)合成培養(yǎng)基(一般為MEM)按比例混合使用(如1：1)。
水解乳蛋白為乳白蛋白經(jīng)蛋白酶和肽酶水解的產(chǎn)物，含有豐富的氨基酸。既可用于**微生物培養(yǎng)，又可用于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)中一般為0.5%水解乳蛋白(經(jīng)平衡鹽溶解)與合成培養(yǎng)基(如MEM)按1：1混合使用。目前在生產(chǎn)中主要用于地鼠腎細(xì)胞等細(xì)胞的培養(yǎng)和維持。但是水解乳蛋白的使用也給生物制品的生產(chǎn)帶來(lái)一定的風(fēng)險(xiǎn)。首先由于水解乳蛋白來(lái)源于動(dòng)物，有可能攜帶傳染源，包括病毒和有毒物質(zhì)。任何一種傳染源都可能對(duì)正在生長(zhǎng)的細(xì)胞系或者制品帶來(lái)風(fēng)險(xiǎn)。其次水解乳蛋白及含有動(dòng)物組分培養(yǎng)基的使用，使生物制品下游處理變得復(fù)雜，這對(duì)于蛋白質(zhì)**顯得更加重要。因?yàn)橛脛?dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)生物藥品，其面臨的*大困難就是如何去除內(nèi)源或同源蛋白。不確定的成分，例如動(dòng)物肽類(lèi)物質(zhì)的引入，勢(shì)必會(huì)增加提取、分離、純化步驟，一方面使成本提高，另一方面也會(huì)影響生物制品的產(chǎn)量和質(zhì)量。
1.3 細(xì)胞培養(yǎng)基&各類(lèi)添加劑(生長(zhǎng)因子等)模式
成分復(fù)雜的培養(yǎng)基還含有許多化合物，包括蛋白質(zhì)、多肽、核苷、檸檬酸循環(huán)的中間產(chǎn)物、丙酮酸及脂類(lèi)等。已發(fā)現(xiàn)當(dāng)培養(yǎng)基中的血清濃度減少時(shí)，這些成分都是必需的。既使在使用血清的情況下，這些成分也可幫助細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)及維持某些特殊細(xì)胞系的生長(zhǎng)。
**和生長(zhǎng)因子在大多數(shù)常規(guī)培養(yǎng)基的配方中都沒(méi)有注明，但在無(wú)血清培養(yǎng)基中通常要加入它們，用其來(lái)代替血清中的**(包括50ng/ml的生長(zhǎng)**和1～10U/ml的胰島素)，它們能增加多種不同類(lèi)型細(xì)胞的貼瓶率;氫化可的松能提高膠質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞的克隆形成率。生長(zhǎng)因子包括FGF家族、EGF、PDGF、IGF-1和IGF-2及白介素等，生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子有著廣泛的特異性，一般與**或其它物質(zhì)起相互協(xié)同或加成作用。
另一種常見(jiàn)的添加物就是血清替代物，目前已有許多可完全或部分替代傳統(tǒng)培養(yǎng)液中血清成分的商業(yè)產(chǎn)品，其穩(wěn)定性較好，但批次間仍有差別，產(chǎn)品的成分也不很確定。
2、細(xì)胞培養(yǎng)基配制
2.1 干粉培養(yǎng)基原倍液的配制
1)配制過(guò)濾**的細(xì)胞培養(yǎng)基
1)閱讀培養(yǎng)基使用說(shuō)明，確定需要添加何種添加劑(如NaHCO3、L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉、HEPES等)。
2)根據(jù)所需將培養(yǎng)基全部倒入一容器中，用少量注射用水(20℃～30℃)將袋內(nèi)殘留培養(yǎng)基洗下，并入容器。加注射用水至總體積的95%，輕微攪拌溶解。
3)加入規(guī)定量的碳酸氫鈉及所要添加的物質(zhì)。
4)輕微攪拌溶解，加注射用水至規(guī)定體積。
5)用1mol/L 氫氧化鈉溶液或1mol/L鹽酸溶液調(diào)pH至所需值。
6)用0.22μm濾膜正壓過(guò)濾**。
7)溶液應(yīng)在2℃～8℃下避光保存。
具體使用方法參照培養(yǎng)基包裝袋上的說(shuō)明書(shū)。
(2) 配制可高壓**細(xì)胞培養(yǎng)基
1)根據(jù)所需將培養(yǎng)基全部倒入一容器中，用少量注射用水(20℃～30℃)將袋內(nèi)殘留培養(yǎng)基洗下，并入容器。加注射用水至總體積的95%，輕微攪拌溶解。
2) 在121℃、15psi下**15分鐘。
3) 待溶液冷卻至室溫，加入無(wú)菌0.2mol/L L-谷氨酰胺溶液規(guī)定體積、無(wú)菌7.5%(w/v)碳酸氫鈉溶液規(guī)定體積，加注射用水(20℃～30℃)至規(guī)定體積，混勻。
4) 如果必要，用1mol/L 氫氧化鈉溶液或1mol / L鹽酸溶液調(diào)pH至所需值。
5) 溶液應(yīng)在2℃～8℃下避光保存。
具體使用方法參照培養(yǎng)基包裝袋上的說(shuō)明書(shū)。
3 注意事項(xiàng)
(1) 細(xì)胞培養(yǎng)用水一般為三蒸水(經(jīng)石英蒸餾器蒸餾)或超純水，醫(yī)藥生產(chǎn)上一般為注射用水。
(2) 建議盡量選擇與所用量相匹配的包裝一次使用，因?yàn)榘b一旦打開(kāi)，組分可能會(huì)變質(zhì)或因受潮而結(jié)團(tuán)。
(3) 溶解干粉培養(yǎng)基時(shí)先加入終體積90%～95%的培養(yǎng)用水，添加劑加完后再補(bǔ)足。
(4) 如需添加的組分較多時(shí)，某一組分完全溶解后，再添加另一組分。
(5) 待培養(yǎng)基完全溶解后再加入碳酸氫鈉，以免產(chǎn)生沉淀。
(6) 所有成分完全溶解后，培養(yǎng)基應(yīng)立即過(guò)濾或高壓**，以免產(chǎn)生沉淀或有微生物污染。
(7) 由于**過(guò)濾后，pH值可能會(huì)升高0.1～0.2個(gè)單位，因此在過(guò)濾前，可將pH調(diào)至比所需值低0.1～0.2個(gè)單位。
(8) 在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，建議不加或加少量的***，如血清的濃度較低則所加***的量也要相應(yīng)降低一些。
(9) 建議用1N HCl或1N NaOH來(lái)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH，因?yàn)橛锰妓釟溻c調(diào)pH值對(duì)培養(yǎng)液的滲透壓影響比較大。如下圖所示：
圖2 MEM SLM(SLM120)在相同pH值時(shí)所加的碳酸氫鈉、氫氧化鈉的量及所對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)液滲透壓
圖3 199(MD502)在相同pH值所加的碳酸氫鈉、氫氧化鈉的量及所對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)液滲透壓
4、**方法
培養(yǎng)基的**方法主要有兩種，高壓**及0.22um微孔濾膜過(guò)濾**。與過(guò)濾相比，高壓**的工作強(qiáng)度小，成本較低，但易造成營(yíng)養(yǎng)成分的流失，而且在多次加樣(無(wú)菌谷氨酰胺溶液，無(wú)菌碳酸氫鈉溶液等)過(guò)程中容易造成二次污染。大多數(shù)培養(yǎng)基采用0.1～0.2μm孔徑的微孔濾膜進(jìn)行過(guò)濾**，并且已成為培養(yǎng)基**的發(fā)展方向，它可低限度地減少培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)損失。
4.1 高壓**
某些培養(yǎng)基(如MEM)可進(jìn)行高壓**，例如清大天一的MEM培養(yǎng)基中的MD605、MD609等。這類(lèi)培養(yǎng)基一般不含有L-谷氨酰胺和碳酸氫鈉，一般是在培養(yǎng)基高壓**后加入L-谷氨酰胺和碳酸氫鈉的無(wú)菌的液體。另外可高壓的谷氨酸鹽(如L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)可代替L-谷氨酰胺。
可高壓**的培養(yǎng)基在121℃、15psi，15分鐘的條件下完全可達(dá)到**效果及營(yíng)養(yǎng)成分的*小損失，不需將**時(shí)間延長(zhǎng)。為保證高壓**的效果，**設(shè)備的驗(yàn)證很關(guān)鍵。
4.2 過(guò)濾**
可供過(guò)濾**使用的濾膜很多，其材料多為polyethersulphone(PES)、尼龍、多聚碳酸鹽、醋酸纖維素、硝酸纖維素、PTFE、陶瓷等。一般情況下采取正壓過(guò)濾，正壓過(guò)濾較之負(fù)壓過(guò)濾具有流速高、過(guò)濾快、不易污染，可避免蛋白質(zhì)產(chǎn)生大量氣泡等優(yōu)點(diǎn)。一般使用過(guò)濾器可參照各供應(yīng)商的產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。
目前大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室和制藥企業(yè)采用微孔濾膜濾器(如Zeiss濾器)或立式微孔濾器(Millipore、Pall)**。微孔濾膜濾器為不銹鋼，中間可夾放0.22um濾膜。使用這種濾器*重要步驟是安裝濾膜及無(wú)菌過(guò)濾過(guò)程。如在使用Zeiss濾器時(shí)，先要用培養(yǎng)用水將濾膜充分潤(rùn)濕，在安裝濾膜時(shí)可在其上放置一層定性濾紙?jiān)俟潭ā?*時(shí)旋鈕不要扭太緊，凡與空氣接觸部位都要包好(可用牛皮紙、紗布、無(wú)紡布等);高壓**后，在無(wú)菌環(huán)境中立即將旋鈕扭緊。過(guò)濾**結(jié)束后，要打開(kāi)濾器，檢查濾膜是否完整，如果濾膜破裂，需重新進(jìn)行過(guò)濾**過(guò)程。立式微孔濾器可以選用不同的微孔濾柱體積，因?yàn)闉V膜的折疊，膜面積顯著增大，液體處理量大，而且不容易發(fā)生堵塞現(xiàn)象。
5、細(xì)胞培養(yǎng)液的儲(chǔ)存
細(xì)胞培養(yǎng)液的儲(chǔ)存條件一般為2～8℃、密閉、避光保存，但要注意如下幾點(diǎn)：
(1) 過(guò)濾后的完全培養(yǎng)液，即添加了血清、谷氨酰胺、***等的培養(yǎng)液要盡快使用，一般在2～3周內(nèi)使用完。
(2) **后的未加L-谷氨酰胺等添加劑的培養(yǎng)基溶液，一般可在4℃保存6～9個(gè)月，也可冷凍保存,用時(shí)解凍。
(3) 高壓**后的培養(yǎng)基應(yīng)置4℃保存，不能因?yàn)槠淇赡褪芨邷囟雎詢(xún)?chǔ)存溫度。
(4) 添加了谷氨酰胺的培養(yǎng)液放置2周后，要補(bǔ)加和原來(lái)同樣量的谷氨酰胺，但這樣并不能消除谷氨酰胺降解產(chǎn)生的游離氨，建議配制好的培養(yǎng)液盡快使用。
圖4 pH為7.6時(shí)不同溫度2mM谷氨酰胺的穩(wěn)定性
圖 5 室溫下不同pH時(shí)10mM谷氨酰胺的穩(wěn)定性
(5) 添加某些生長(zhǎng)因子、**等添加物，可能會(huì)改變培養(yǎng)液的儲(chǔ)存條件，比如溫度、時(shí)間等方面的要求。
細(xì)胞培養(yǎng)基從1903年開(kāi)始發(fā)展到現(xiàn)在，有199、MEM、DMEM、RPMI1640等基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基，還有低血清細(xì)胞培養(yǎng)基、無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基甚至無(wú)蛋白培養(yǎng)基，種類(lèi)繁多、各具特點(diǎn)。在使用過(guò)程中，只有根據(jù)各類(lèi)細(xì)胞培養(yǎng)基的特性、特點(diǎn)正確的選擇配制方法、**方法、儲(chǔ)存方法，才能*大程度地保持細(xì)胞培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)，發(fā)揮細(xì)胞培養(yǎng)基的功效。
公安機(jī)關(guān)備案號(hào)：
