SPE固相萃取技術(shù)（固相萃取儀器裝置）(五)
1.樣品前處理的重要性
無論是對樣品的化學(xué)分析還是在生物工程中，樣品的分離、純化都是必不可少的前處理步驟。樣品前處理的好壞將直接影響*后的結(jié)果。
根據(jù)LC-GC Int.雜志對世界1000多個(gè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行的統(tǒng)計(jì)，樣品前處理所花費(fèi)的時(shí)間占整個(gè)分析過程的 61%現(xiàn)代的自動(dòng)化分析儀器使分析工作趨向簡單、快速。然而，許多擁有現(xiàn)代化分析儀器的實(shí)驗(yàn)室卻依然使用著古老、繁瑣的樣品前處理方法。樣品前處理已經(jīng)成為現(xiàn)代分析中的瓶頸，嚴(yán)重阻礙了分析工作的進(jìn)行。因此，要提高效率，就必須解決樣品前處理的問題。
根據(jù)同一份統(tǒng)計(jì)報(bào)告可以看到在整個(gè)色譜分析的過程中，樣品前處理產(chǎn)生的誤差*大, 高達(dá) 30%，如果再加上操作誤差，人為的因素占了誤差來源的近50% 換句話來說，如果我們能解決人為因素造成的誤差，分析誤差產(chǎn)生的幾率就降低了一半。
不同的檢測手段對樣品前處理的要求也不相同。其主要目的大都在于：
1.將目標(biāo)化合物從基質(zhì)中分離出來；
2.盡可能地除去對目標(biāo)化合物的分析有干擾的組分；
3.盡可能地除去對分析儀器造成傷害的物質(zhì)；
4.對目標(biāo)化合物進(jìn)行濃縮以達(dá)到分析儀器的檢測下限；
5.調(diào)整樣品的pH值、離子強(qiáng)度以滿足分析儀器檢測要求。
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2.JTONE固相萃取基本原理
2.1吸附目標(biāo)化合物模式
在吸附目標(biāo)化合物模式中，SPE柱對目標(biāo)化合物的吸附力大于樣品基液。如下圖所示，當(dāng)樣品通過SPE柱時(shí)，目標(biāo)化合物被吸附在固體填料表面，其它大部分的樣品組份則隨基質(zhì)通過柱子。目標(biāo)化合物可用適當(dāng)溶劑洗脫下來。為了方便起見，我們將這種萃取模式稱為“吸附目標(biāo)化合物模式”或“目標(biāo)化合物吸附模式”在這種萃取模式中，SPE柱在吸附目標(biāo)化合物的同時(shí)，可能也會(huì)吸附一些對分析有影響的干擾物。因此，在對目標(biāo)化合物進(jìn)行洗脫之前，要對SPE柱進(jìn)行洗滌，*大限度地**這些干擾物。
如上圖所示，吸附目標(biāo)化合物模式可以分為以下幾個(gè)步驟：
SPE柱預(yù)處理（棄去過柱液體）
樣品過SPE柱（棄去過柱液體）
SPE柱洗滌及干燥（棄去過柱液體）
目標(biāo)化合物洗脫（收集過柱液體）
2.2吸附雜質(zhì)模式
在固相萃取過程中，當(dāng)樣品通過SPE柱時(shí)，SPE柱吸附樣品中的雜質(zhì)，而目標(biāo)化合物隨樣品基質(zhì)通過SPE柱。我們稱之為“吸附雜質(zhì)模式”或“雜質(zhì)吸附模式”，這種模式多用于樣品凈化。在這種萃取模式中，樣品過柱后的組分和柱洗滌的組分要一并收集。與目標(biāo)化合物吸附模式不同，雜質(zhì)吸附模式中的柱洗滌是要將殘留在SPE柱上的目標(biāo)化合物洗脫下來，而將雜質(zhì)保留在SPE柱上。
在吸附雜質(zhì)模式中可以分為以下幾個(gè)步驟：
SPE柱預(yù)處理（棄去過柱液體）
樣品過SPE柱（收集過柱液體）
SPE柱洗滌（收集過柱液體至上述收集液體的試管中）
3.JTONE固相萃取中的主要作用力
3.1固相萃取中的非極性作用力
固相萃取中的非極性作用力產(chǎn)生于固相萃取材料功能團(tuán)上的碳?xì)滏I與樣品中化合物的碳?xì)滏I之間。這種作用力既為人們所熟悉的范德華引力或散射力。由于有機(jī)分子或多或少都存在這種非極性結(jié)構(gòu)，非極性作用力常常被用于從樣品基質(zhì)中吸附分離具有非極性結(jié)構(gòu)的化合物。
使用*多的非極性SPE柱是具由十八個(gè)碳組成的碳鏈官能團(tuán)，俗稱為C18柱。由于C18材料在液相色譜中廣泛使用，所以人們對其性能也較為了解，在SPE中也大量使用。一般說來，非極性SPE柱通用性比較好。所以比較適合用于同時(shí)萃取多種不同化學(xué)性質(zhì)的化合物。但其選擇性則比極性或離子交換作用力差。
通常，非極性SPE柱較適用于從極性基質(zhì)中萃取分離非極性及中等極性的目標(biāo)化合物。
對于通過非極性作用力吸附在非極性SPE柱上的目標(biāo)化合物，可以用具有非極性性質(zhì)的溶劑洗脫，如氯仿、環(huán)己烷等。即便是極性較強(qiáng)的甲醇對于許多化合物來說也具有足夠的非極性作用力將其洗脫。
3.2固相萃取中的極性作用力
固相萃取中的極性作用力在許多固相萃取材料官能團(tuán)及樣品中的化合物都可以發(fā)生。極性作用力包括：氫鍵、偶極力/偶極力、誘導(dǎo)偶極力、π-π等。如： 羥基、氨基、巰基, 羰基、芳香環(huán)及含氧、氮、硫、磷等雜原子的基團(tuán)。其中氫鍵是*常見的極性作用力。
非極性的基質(zhì)環(huán)境有利于吸附劑和目標(biāo)化合物之間的極性作用力；極性環(huán)境有利于破壞吸附劑和目標(biāo)化合物之間的極性作用力；環(huán)境離子強(qiáng)度大也不利于吸附劑和分析物之間的極性作用力。
值得指出的是所有以鍵合硅膠為材料的SPE柱，由于鍵合硅膠本身具有一定數(shù)量的沒有鍵合的 –OH基團(tuán)（沒有封尾），所以都具有極性。這種極性功能在非極性溶劑中*明顯。
在極性萃取中常用的洗脫溶劑有：甲醇、水、THF、異丙醇、乙酸、乙腈、丙酮、胺類、高離子強(qiáng)度緩沖液或上述溶液的混合液。
3.3固相萃取中的離子作用力
離子作用力發(fā)生在帶相反電荷的樣品化合物與SPE填料官能團(tuán)之間。對有機(jī)化合物而言，能夠產(chǎn)生離子交換作用的化合物官能團(tuán)有兩類：
1.可生成陽離子的官能團(tuán)（帶正電荷）
2.可生成陰離子的官能團(tuán)（帶負(fù)電荷）
常見陽離子的官能團(tuán)包括：伯，仲，叔，丁胺類。
常見陰離子的官能團(tuán)包括：羰基，磺酸基，磷酸基等。
要正確使用離子交換柱進(jìn)行固相萃取，必須注意控制萃取環(huán)境。為了有效地利用離子交換機(jī)理將目標(biāo)化合物吸附在固相柱上，必須滿足以下兩個(gè)條件：
1. 環(huán)境的pH必需使分析物和吸附劑帶相反電荷
2. 環(huán)境不能含有高濃度帶有和分析物相同電荷的競爭化合物
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在實(shí)際操作中為了確保目標(biāo)化合物及SPE填料官能團(tuán)能夠99%以上帶電或呈中性（不帶電），可以根據(jù)目標(biāo)化合物及SPE填料官能團(tuán)的pKa來決定。
要用陰離子交換劑將可生成陰離子的弱酸性化合物 99%吸附，目標(biāo)化合物所處環(huán)境體系的pH值要高于該目標(biāo)化合物的pKa兩個(gè)pH單位。要使99%目標(biāo)化合物脫附，則環(huán)境體系的pH值必須低于該化合物的pKa兩個(gè)pH單位。
反之，要用陽離子交換劑將可生成陽離子的弱堿性化合物99%吸附，環(huán)境體系的pH值必須低于該化合物的pKa兩個(gè)pH單位。要使99%該化合物脫附, 體系環(huán)境的pH值必須高于該化合物的pKa兩個(gè)pH單位。
在應(yīng)用離子交換作用力進(jìn)行SPE萃取時(shí)還必須考慮離子強(qiáng)度和選擇性。一般說來，低離子強(qiáng)度有利于分析物的吸附，高離子強(qiáng)度有利于分析物的脫附。離子交換劑選擇性的強(qiáng)弱取決于其功能團(tuán)的性質(zhì)。如：對檸檬酸陰離子而言，季胺(強(qiáng)陰離子交換劑)就優(yōu)于醋酸根陰離子的250倍。因此，用醋酸根陰離子溶液處理的季胺吸附劑對分析物的吸附力遠(yuǎn)比用檸檬酸陰離子溶液處理的季胺吸附劑強(qiáng)。反之,檸檬酸陰離子溶液是一個(gè)好的洗脫劑。
在應(yīng)用離子交換SPE萃取時(shí)，了解目標(biāo)化合物的pKa對于調(diào)節(jié)樣品的pH值十分重要。但是由于種種原因，常常不知道其pKa。這就給實(shí)驗(yàn)帶來了一定的盲目性。在這種情況下，我們可以參考官能團(tuán)的pKa值來調(diào)節(jié)樣品的pH。由于同一官能團(tuán)在不同分子中所處的位置不同，化合物的立體結(jié)構(gòu)也不同，官能團(tuán)的pKa值與含有該官能團(tuán)的化合物的pKa值是有所差異的。
在陰離子交換萃取中，目標(biāo)化合物可以通過以下五種方式進(jìn)行洗脫：
1.pH高于填料官能團(tuán)pKa兩個(gè)pH單位的緩沖溶液。在該pH條件下，陰離子交換劑的官能團(tuán)呈中性。
2.pH低于帶有陰離子官能團(tuán)的目標(biāo)化合物兩個(gè)pH單位的緩沖液。在該pH條件下，目標(biāo)化合物的陰離子官能團(tuán)呈中性。
3.高離子強(qiáng)度緩沖溶液（>
4.洗脫液為含有高選擇性的陰離子。由于這些陰離子對吸附劑陰離子交換官能團(tuán)具有很高的吸引力，可以將目標(biāo)化合物從陰離子交換柱上交換出來，從而達(dá)到洗脫分離的目的。
5.上述幾種方法的結(jié)合使用也可以達(dá)到洗脫陰離子目標(biāo)化合物的目的。
在陽離子交換萃取中，洗脫溶劑的選擇原則與陰離子交換柱相反：
1.洗脫溶劑的pH低于吸附劑的陽離子交換官能團(tuán)pKa兩個(gè)pH單位。這樣就可以使該官能團(tuán)呈中性，將目標(biāo)化合物釋放出來。
2.洗脫溶劑的pH高于目標(biāo)化合物pKa兩個(gè)pH單位。在此條件下，目標(biāo)化合物呈中性狀態(tài)，與吸附劑陽離子官能團(tuán)分離，被洗脫溶劑洗脫出來。常?？梢栽诩状贾屑尤霘溲趸c、氫氧化鉀或氨水來實(shí)現(xiàn)pH的調(diào)節(jié)及目標(biāo)化合物的洗脫。如果需要降低洗脫餾分中水的含量，則可以在有機(jī)溶劑中加入1%~2%的有機(jī)胺來實(shí)現(xiàn)這種洗脫。
3.洗脫溶劑為高陽離子強(qiáng)度 (>0.1 mol/L)的緩沖溶液。高陽離子濃度會(huì)導(dǎo)致陰陽離子與目標(biāo)化合物產(chǎn)生競爭，將目標(biāo)化合物釋放出來。
4.洗脫液為含有高選擇性的陽離子。由于這些陽離子具有對填料陽離子官能團(tuán)具有很高的吸引力，可以將目標(biāo)化合物從陽離子交換柱上交換出來，從而達(dá)到洗脫分離的目的。
5.上述幾種方法的結(jié)合使用也可以達(dá)到洗脫陽離子目標(biāo)化合物的目的。
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3.4JTONE固相萃取中的多種作用力
在固相萃取中常見的多種作用力有兩類。一類是固相萃取材料本身所具有的，如以鍵合硅膠為基質(zhì)的固相萃取材料；另一類是人為引入的，如混合型SPE柱。有關(guān)混合型SPE柱請參閱相關(guān)資料。
必需強(qiáng)調(diào)，幾乎全部的鍵合硅膠都存在多于一種以上的作用力。因此，在考慮固相萃取方法時(shí)應(yīng)該綜合考慮各種作用力對萃取過程的影響。
鍵合硅膠柱存在的付作用力對于目標(biāo)化合物的萃取有時(shí)是不利的，應(yīng)該盡量避免。但這種副作用力有時(shí)是有利的，應(yīng)該充分利用。
常見鍵合硅膠SPE柱多種作用力
| 功能團(tuán) | 非極性 | 極性 | 陰離子交換 | 陽離子交換 |
| C18 | ● | ○ | | ? |
| C8 | ● | ○ | | ? |
| C2 | ● | ● | | ? |
| CH | ● | ○ | | ? |
| PH | ● | ○ | | ? |
| CN | ● | ● | | ? |
| 2OH | ● | ● | | ? |
| SI | | ● | | ? |
| NH2 | ○ | ● | ● | ? |
| PSA | ○ | ● | ● | ? |
| DEA | ○ | ● | ● | ? |
| SAX | ○ | ○ | ● | ? |
| CBA | ○ | ○ | | ● |
| PRS | ○ | ○ | | ● |
| SCX | ● | ○ | | ● |
● ─ 主作用力 2OH ─ 二醇基 (Diol)
○ ─ **作用力 SI ─ 未鍵合硅醇基
? ─ 活性硅醇基 NH2 ─ 丙氨基 (Aminopropyl)
C18 ─十八烷基 (Octadecyl) PSA ─ 一元/二元氨基- (Ethylenediamine-N-propyl)
C8 ─ 辛烷基 (Octyl) DEA ─二乙基丙氨 (Diethylaminopropyl)
C2 ─ 乙烷基 (Ethyl) SAX ─ **基丙基胺 (Trimethylaminoprooyl)
CH ─ 環(huán)己基 (Cyclohexyl) CBA ─ 甲羧酸基 (Carboxymethyl, H-form)
PH ─ 苯基 (Phenyl) PRS ─ 丙磺酸基 (Sulfonylpropyl, Na-form)
CN ─ 氰基 (CN) CX ─ 苯丙磺酸基 (Propylbenzenesulfonly, H- form)
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公安機(jī)關(guān)備案號(hào)：
