一、氨基酸分析方法分類
氨基酸分析按其分離和檢測方法的不同可分為三大類型。**類是基于陽離子交換柱分離、柱后茚三酮衍生、光度法測定的離子交換色譜法（IEC）。此類方法由Stein和Moore兩人1958年發(fā)明，并于1972年獲諾貝爾獎，是當今國際標準和國家標準以及仲裁和涉外的方法。**類是所有基于反相色譜分離、柱前衍生、熒光或紫外檢測的高效液相法（HPLC）。第三類是陰離子交換分離直接安培法檢測的離子色譜法IC，嚴格說來，陰離子交換和陽離子交換都叫“IEC”，在此將陰離子交換分離、安培檢測的方法歸類為IC，是因為這類儀器實際上就是離子色譜儀，只不過配置側(cè)重點為氨基酸分析。本文中對三類方法多用簡稱。
氨基酸分析方法的分類和特性比較表
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方法
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IEC
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HPLC
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IC
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原理
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陽離子交換分離、柱后茚三酮衍生光度法測定
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高效液相反相色譜分離、柱前衍生、光度法測定
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陰離子交換直接測定
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衍生試劑
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茚三酮
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PITC
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OPA
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FMOC
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AQC
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DABS-Cl
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無
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基體干擾
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無
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有
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有
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有
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有
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有
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有
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多余試劑
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不干擾
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需除去
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不干擾
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需除去
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不干擾
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需除去
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無
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可見光
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UV
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熒光
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熒光
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熒光
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UV
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脈沖安培
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檢測限
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5-10 pmol
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30pmol
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1pmol
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1pmol
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1pmol
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30pmol
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0.5pmol
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優(yōu)點
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方法成熟可靠。穩(wěn)定性、重現(xiàn)性、線性均優(yōu)于HPLC法，柱子壽命長，幾乎可分析已知的所有氨基酸（*多可同時分離50余種）
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對一些氨基酸有很高的靈敏度，分析時間較短，儀器可一機多用（在氨基酸分析和其它分析轉(zhuǎn)換時，需要更換一些部件，如柱子、緩沖液等，通常更換之后還需要較長時間重新平衡系統(tǒng)）
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缺點
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對大多數(shù)氨基酸的靈敏度不如HPLC法和IC法。儀器專用化，售價較高
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衍生反應(yīng)和產(chǎn)物穩(wěn)定性常受基體和過量試劑干擾，方法的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性、線性和可靠性不如茚三酮法，能分離分析的氨基酸種類較少。且柱子壽命短，衍生試劑一般較貴，方法對操作技術(shù)要求高。（其中個別方法的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性、線性等指標已接近IEC法，但衍生試劑是****，售價極高，總體成本甚至超過IEC法的儀器）
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易受**干擾，測量結(jié)果與茚三酮法有較大差異，穩(wěn)定性、重現(xiàn)性與HPLC法接近
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說明： 1、PITC異硫氰酸苯酯；OPA鄰苯二甲醛；FMOC 9-芴基甲氧羰酰氯；AQC 6-氨基-喹啉基-N-羥基琥貝酰亞胺-氨基甲酸酯；DABS-Cl 二甲基氨基偶氮苯磺酰氯。
2、IEC法也可使用柱后OPA衍生（熒光檢測），可以降低檢測限到1pmol，但無法檢測二級氨基酸。
二、用戶如何選擇適合自己的方法和儀器
氨基酸分析的方法和儀器多種多樣，用戶應(yīng)該根據(jù)自己的實際應(yīng)用情況和發(fā)展趨勢來選擇方法和儀器。選擇時可參考以下幾個方面：
是否需要對分析結(jié)果負責（如對外出具報告等）
IEC儀器使用茚三酮柱后衍生法，符合國家標準和國際仲裁標準，而IC法和HPLC法雖然總體性能也比較穩(wěn)定可靠，但其測量結(jié)果與茚三酮法有較大差異，且結(jié)果難以長期重復(fù)，這對于仲裁不利。目前，IC法和HPLC法分析氨基酸一般僅用于不太深入的研究，而且主要是利用其靈敏度較高的特性。也有部分企業(yè)用來做內(nèi)部質(zhì)量控制（國家沒有制定相關(guān)標準），但如果要考慮對外做樣并出具結(jié)果報告，IEC儀器是**選擇。由于國內(nèi)的氨基酸分析呈現(xiàn)急劇上升的勢頭，而很多單位經(jīng)濟能力有限，因此也確有不少單位購買專用氨基酸分析儀作為創(chuàng)收手段。
一次進樣需要出峰的數(shù)量是多還是少 氨基酸種類繁多、性質(zhì)接近，因此氨基酸分析是色譜界公認的難題，盡管現(xiàn)在有多種多樣的方法，但沒有任何方法能夠保證所有氨基酸峰能夠一次進樣完全的分離。僅僅從分離程度來說，好的HPLC方法*多可以一次分離檢測20種左右的氨基酸峰，IC法*多可一次分離檢測約30種氨基酸峰（理論上說來，IC法可達到與IEC法相當?shù)某龇鍞?shù)量，但金電極的基線漂移較大，保留時間太長的峰就難以定量分析），IEC法*多一次可分離檢測50種左右的氨基酸峰。從這個角度來說，如果您需要分析游離氨基酸樣品，就應(yīng)當選擇IEC儀器。
3、 氨基酸分析頻率高還是低
氨基酸樣品分析頻率如果達到每個星期至少1次，就可以算“頻率較高”，少于每周1次就可以說是“較低”。頻率較高時，應(yīng)當儀器專用化（即便是用HPLC和IC法，也應(yīng)專用于氨基酸分析），因為反復(fù)更換柱子和緩沖體系不僅麻煩、平衡時間長，難以保證分析結(jié)果的可靠性和重復(fù)性，而且容易損壞儀器。
氨基酸樣品總量是多還是少總體的成本應(yīng)考慮到做樣成本，而不能只看儀器本身。HPLC做氨基酸分析時，每根柱子只能進樣100－500針，而IEC儀器的柱子都超過1000針（sykam柱子使用國產(chǎn)試劑時大于4000針，使用進口試劑時大于6000針）。
如果都使用國產(chǎn)試劑，HPLC儀器單針成本平均160元人民幣，IEC儀器單針成本平均不到20元人民幣，IC儀器單針成本平均60元人民幣（IC法無需衍生劑，但檢測電極是消耗品）。此處計算了標樣、緩沖溶液、衍生劑、柱子等消耗品價格，而儀器的維護保養(yǎng)費用相同（未計算）。下表是專用氨基酸分析儀IEC、HPLC和IC（都配置自動進樣，HPLC加配氨基酸分析包）的總成本分析。
三種分析方法的總費用比較
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總費用
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IEC
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HPLC（平均值）
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IC
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初次花費
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65萬－75萬
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30萬－40萬
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55萬－65萬
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600個樣品（1500針）
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68萬－78萬
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54萬－64萬
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64萬－74萬
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1000個樣品（2500針）
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70萬－80萬
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70萬－80萬
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70萬－80萬
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2000個樣品（5000針）
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75萬－85萬
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110萬－120萬
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85萬－95萬
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也就是說，當分析樣品量超過 1000 個（進樣針數(shù)大于 2500），IEC 專用氨基酸分析儀就開始成為 費用*低的儀器了。通常儀器的使用壽命超過 8 年（平均 10 年左右），只要每年的樣品量大于 100 個， IEC 儀器就沒有價格上的劣勢。
三、哪些儀器是“氨基酸分析儀”
我們已經(jīng)比較了 HPLC、IC 和 IEC 這三大類氨基酸分析方法，總的說來，它們適合不同情況下的應(yīng)用， 雖然 IEC 茚三酮柱后衍生法適應(yīng)范圍更廣泛，但儀器售價也明顯要高。目前中國市場上號稱是專用氨基酸 分析儀的有很多，對于用戶而言，也未必需要去分辯誰是真正的專用氨基酸分析儀，而且國家儀器名錄甚 至國際上都沒有明確提出專用氨基酸分析儀的定義，但在中國市場，無論是使用者還是儀器廠家，一般都 是把陽離子交換分離、茚三酮柱后衍生法儀器叫作“氨基酸分析儀”。這類儀器技術(shù)門檻較高，國內(nèi)目前 還沒有廠家生產(chǎn)此類儀器，代表廠商有德國 sykam、日本 hitachi 等。而 IC 法儀器的代表是 Dionex 公司的 AAA-direct。
四、IEC 儀器之間的比較
IEC儀器也有幾個廠家生產(chǎn)，用戶該如何選擇？ **，當然是滿足分析需要的技術(shù)指標如分離度、重復(fù)性等要求，而其中的分離度又是更為重要的指 標，因為，色譜理論一般以分離度達到 1.2 作為兩峰基本分離的判定前提，只有峰分開了，才有意義去討 論定性和定量的重復(fù)性。 **，應(yīng)考慮儀器的可靠性。如果儀器今天堵了、明天漏了，用戶不僅要付出大量人力財力，分析結(jié) 果的可信度也將大打折扣。 第三，應(yīng)考慮儀器的運行成本。例如是否可以使用國產(chǎn)試劑、柱子壽命（以多少次進樣計算、而不以 多少年計算）等。 第四，應(yīng)考慮儀器設(shè)計是否有利于氨基酸分析，例如是否有惰性氣體保護（茚三酮極易被氧化）、是 否提供在線脫氣、是否提供溶液和樣品的制冷控制等。 第五，應(yīng)考慮售后服務(wù)。分析過程中遇到困難是在所難免，廠家必須能夠快速響應(yīng)、盡快解決問題。 另外，常用備件的價格也是一個重要因素，因為用戶在購買前一般難以注意到售后的問題，而很多廠家也 沒有公示自己的常用備件價格，這就為將來的使用埋下了隱患，事實上，也的確有很多儀器（尤其是進口 儀器）在出現(xiàn)一些看似微小的故障之后，就因為維修費用太高而被“束之高閣”。
聲明：
1、 本文部分資料引用自《儀器信息網(wǎng)》中公開的文章，在此對作者表示感謝！
2、 本文旨在為讀者提供一個了解氨基酸分析方法和儀器的參考，若對文中觀點存有異議， 歡迎指正。
《氨基酸分析方法及儀器比較》
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