前言
本標準代替GB/T 4789.3-2008《食品衛(wèi)生微生物學檢驗大腸菌群計數(shù)》。
本標準與GB/T 4789.3-2008相比，主要修改如下：
——修改了標準的中英文名稱；
——“**法大腸菌群平板計數(shù)法”的平板菌落數(shù)的選擇范圍修改為“15 CFU～150 CFU”；
——刪除了“第三法大腸菌群PetrifilmTM 測試片法”。
本標準的附錄A、附錄B為規(guī)范性附錄。
本標準所代替標準的歷次版本發(fā)布情況為：
——GB 4789.3-1984、GB 4789.3-1994、GB /T 4789.3-2003、GB /T 4789.3-2008。
食品***家標準
食品微生物學檢驗 大腸菌群計數(shù)
1 范圍
本標準規(guī)定了食品中大腸菌群（Coliforms）計數(shù)的方法。
本標準適用于食品中大腸菌群的計數(shù)。
2 術語和定義
2.1 大腸菌群coliforms
在一定培養(yǎng)條件下能發(fā)酵乳糖、產酸產氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無芽胞桿菌。
2.2 *可能數(shù)most probable number，MPN
基于泊松分布的一種間接計數(shù)方法。
3 設備和材料
除微生物實驗室常規(guī)**及培養(yǎng)設備外，其他設備和材料如下：
3.1 恒溫培養(yǎng)箱：36 ℃±1 ℃。
3.2 冰箱：2 ℃～5 ℃。
3.3 恒溫水浴箱：46 ℃±1 ℃。
3.4 天平：感量0.1 g。
3.5 均質器。
3.6 振蕩器。
3.7 無菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸頭。
3.8 無菌錐形瓶：容量500 mL。
3.9 無菌培養(yǎng)皿：直徑90 mm。
3.10 pH 計或pH 比色管或精密pH 試紙。
3.11 菌落計數(shù)器。
4 培養(yǎng)基和試劑
4.1 月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（Lauryl Sulfate Tryptose，LST）肉湯：見附錄A 中A.1。
4.2 煌綠乳糖膽鹽（Brilliant Green Lactose Bile，BGLB）肉湯：見附錄A 中A.2。
4.3 結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（Violet Red Bile Agar，VRBA）：見附錄A 中A.3。
4.4 磷酸鹽緩沖液：見附錄A 中A.4。
4.5 無菌生理鹽水：見附錄A 中A.5。
4.6 無菌1 mol/L NaOH：見附錄A 中A.6。
4.7 無菌1 mol/L HCl：見附錄A 中A.7。
**法 大腸菌群MPN 計數(shù)法
5 檢驗程序
大腸菌群MPN計數(shù)的檢驗程序見圖1。
6 操作步驟
6.1 樣品的稀釋
6.1.1 固體和半固體樣品：稱取25 g 樣品,放入盛有225 mL 磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質杯內,8000 r/min～10000 r/min 均質1 min～2 min,或放入盛有225 mL 磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質袋中，用拍擊式均質器拍打1 min～2 min，制成1:10 的樣品勻液。
6.1.2 液體樣品：以無菌吸管吸取25 mL 樣品置盛有225 mL 磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶（瓶內預置適當數(shù)量的無菌玻璃珠）中，充分混勻，制成1:10 的樣品勻液。
6.1.3 樣品勻液的pH 值應在6.5～7.5 之間，必要時分別用1 mol/L NaOH 或1 mol/L HCl 調節(jié)。
6.1.4 用1 mL 無菌吸管或微量移液器吸取1:10 樣品勻液1 mL，沿管壁緩緩注入9 mL 磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌試管中（注意吸管或吸頭**不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1 支1 mL 無菌吸管反復吹打，使其混合均勻，制成1:100 的樣品勻液。
6.1.5 根據(jù)對樣品污染狀況的估計，按上述操作，依次制成十倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1 次，換用1 支1 mL 無菌吸管或吸頭。從制備樣品勻液至樣品接種完畢，全過程不得超過15 min。
6.2 初發(fā)酵試驗
每個樣品，選擇3個適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液（液體樣品可以選擇原液），每個稀釋度接種3管月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯，每管接種1mL（如接種量超過1 mL，則用雙料LST肉湯），36℃±1 ℃培養(yǎng)24 h±2 h，觀察倒管內是否有氣泡產生，24 h±2 h產氣者進行復發(fā)酵試驗，如未產氣則繼續(xù)培養(yǎng)至48 h±2 h，產氣者進行復發(fā)酵試驗。未產氣者為大腸菌群陰性。
6.3 復發(fā)酵試驗
用接種環(huán)從產氣的LST肉湯管中分別取培養(yǎng)物1環(huán)，移種于煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB）管中，36 ℃±1℃培養(yǎng)48 h±2 h，觀察產氣情況。產氣者，計為大腸菌群陽性管。
6.4 大腸菌群*可能數(shù)（MPN）的報告
按6.3確證的大腸菌群LST陽性管數(shù)，檢索MPN表（見附錄B），報告每g（mL）樣品中大腸菌群的MPN值。
**法 大腸菌群平板計數(shù)法
7 檢驗程序
大腸菌群平板計數(shù)法的檢驗程序見圖2。
8 操作步驟
8.1 樣品的稀釋
按6.1進行。
8.2 平板計數(shù)
8.2.1 選取2個～3個適宜的連續(xù)稀釋度, 每個稀釋度接種2個無菌平皿，每皿1 mL。同時取1 mL生理鹽水加入無菌平皿作空白對照。
8.2.2 及時將15 mL～20 mL冷至46 ℃的結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）約傾注于每個平皿中。小心旋轉平皿，將培養(yǎng)基與樣液充分混勻，待瓊脂凝固后，再加3 mL～4 mLVRBA覆蓋平板表層。翻轉平板，置于36 ℃±1 ℃培養(yǎng)18 h～24 h。
8.3 平板菌落數(shù)的選擇
選取菌落數(shù)在15 CFU～150 CFU 之間的平板，分別計數(shù)平板上出現(xiàn)的典型和可疑大腸菌群菌落。典型菌落為紫紅色，菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán)，菌落直徑為0.5 mm 或更大。
8.4 證實試驗
從VRBA 平板上挑取10 個不同類型的典型和可疑菌落，分別移種于BGLB 肉湯管內，36 ℃±1 ℃培養(yǎng)24 h～48 h，觀察產氣情況。凡BGLB 肉湯管產氣，即可報告為大腸菌群陽性。
8.5 大腸菌群平板計數(shù)的報告
經*后證實為大腸菌群陽性的試管比例乘以8.3中計數(shù)的平板菌落數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù)，即為每g（mL）樣品中大腸菌群數(shù)。例：10-4樣品稀釋液1 mL，在VRBA平板上有100個典型和可疑菌落，挑取其中10個接種BGLB肉湯管，證實有6個陽性管，則該樣品的大腸菌群數(shù)為：100×6/10×104/g（mL）=6.0×105CFU/g（mL）。
附錄A（規(guī)范性附錄）
培養(yǎng)基和試劑
A.1 月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯
A.1.1 成分
胰蛋白胨或胰酪胨 20.0 g
氯化鈉 5.0 g
乳糖 5.0 g
磷酸氫二鉀（K2HPO4） 2.75 g
磷酸二氫鉀（KH2PO4） 2.75 g
月桂基硫酸鈉 0.1 g
蒸餾水 1 000 mL
pH 6.8±0.2
A.1.2 制法
將上述成分溶解于蒸餾水中，調節(jié) pH。分裝到有玻璃小倒管的試管中，每管10 mL。121 ℃高壓**15 min。
A.2 煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯
A.2.1 成分
蛋白胨 10.0 g
乳糖 10.0 g
牛膽粉（oxgall或oxbile）溶液 200 mL
0.1%煌綠水溶液 13.3 mL
蒸餾水 800 mL
pH 7.2±0.1
A.2.2 制法
將蛋白胨、乳糖溶于約500 mL蒸餾水中，加入牛膽粉溶液200 mL（將20.0 g脫水牛膽粉溶于200 mL蒸餾水中，調節(jié)pH至7.0～7.5），用蒸餾水稀釋到975 mL，調節(jié)pH，再加入0.1%煌綠水溶液13.3 mL，用蒸餾水補足到1 000 mL，用棉花過濾后，分裝到有玻璃小倒管的試管中，每管10 mL。121 ℃高壓**15 min。
A.3 結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）
A.3.1 成分
蛋白胨 7.0 g
酵母膏 3.0 g
乳糖 10.0 g
氯化鈉 5.0 g
膽鹽或3號膽鹽 1.5 g
中性紅 0.03 g
結晶紫 0.002 g
瓊脂 15 g～18 g
蒸餾水 1 000 mL
pH 7.4±0.1
A.3.2 制法
將上述成分溶于蒸餾水中，靜置幾分鐘，充分攪拌，調節(jié)pH。煮沸2 min，將培養(yǎng)基冷卻至45 ℃～50 ℃傾注平板。使用前臨時制備，不得超過3 h。
A.4 磷酸鹽緩沖液
A.4.1 成分
磷酸二氫鉀（KH2PO4） 34.0 g
蒸餾水 500 mL
pH 7.2
A.4.2 制法
貯存液：稱取34.0 g的磷酸二氫鉀溶于500 mL蒸餾水中，用大約175 mL的1 mol/L氫氧化鈉溶液調節(jié)pH，用蒸餾水稀釋至1 000 mL后貯存于冰箱。
稀釋液：取貯存液1.25 mL，用蒸餾水稀釋至1 000 mL，分裝于適宜容器中，121 ℃高壓**15 min。
A.5 無菌生理鹽水
A.5.1 成分
氯化鈉 8.5 g
蒸餾水 1 000 mL
A.5.2 制法
稱取8.5ｇ氯化鈉溶于1 000 mL蒸餾水中，121 ℃高壓**15 min。
A.6 1 mol/L NaOH
A.6.1 成分
NaOH 40.0 g
蒸餾水 1000 mL
A.6.2 制法
稱取40 g氫氧化鈉溶于1 000 mL蒸餾水中，121 ℃高壓**15 min。
A.7 1 mol/L HCl
A.7.1 成分
HCl 90 mL
蒸餾水 1 000 mL
A.7.2 制法
移取濃鹽酸90 mL，用蒸餾水稀釋至1 000 mL，121 ℃高壓**15 min。
公安機關備案號：
