1、色譜起源
2、色譜定義
色譜法：利用組分在兩相間分配系數(shù)不同而進(jìn)行分離的技術(shù)
流動(dòng)相：攜帶樣品流過(guò)整個(gè)系統(tǒng)的流體
固定相：靜止不動(dòng)的一相，色譜柱
色譜是一種分離技術(shù).
色譜的主要目的是對(duì)混合物中的目標(biāo)物分離和定量
3、色譜分類(lèi)
1、高效液相色譜 High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
2、氣相色譜 Gas Chromatography (GC)
3、薄層色譜 Thin-Layer Chromatography (TLC)
4、毛細(xì)管電泳 Capillary Electrophoresis(CE)
4、色譜優(yōu)點(diǎn)
1、同時(shí)分析
2、分離性能好
3、靈敏度高 (ppm-ppb)
4、進(jìn)樣量小 (1-100uL)
HPLC vs GC
液相色譜：以液體作為流動(dòng)相的色譜分離方法
1、適用于高沸點(diǎn)、大分子、強(qiáng)極性和熱穩(wěn)定性差的化合物的分析
2、流動(dòng)相具有運(yùn)載樣品分子和選擇性分離的雙重作用
氣相色譜：以氣體作為流動(dòng)相的色譜分離方法
1、適用于沸點(diǎn)較低、熱穩(wěn)定性好的中小分子化合物的分析
2、流動(dòng)相只起運(yùn)載樣品分子的能力
5、HPLC分類(lèi)
1、正相模式 (NP-LC)
2、反相模式 (RP-LC)
3、反相離子對(duì)色譜 (IPC)
4、離子交換色譜 (IEC)
5、尺寸排阻色譜 (GPC / GFC)
反相模式 (RP)
填料：C18 (ODS)、C8 (octyl)、C4 (butyl)、苯基、TMS和氰基
相互作用力：
反相模式下流動(dòng)相的選擇：
優(yōu)化水相（緩沖液）和有機(jī)相的比例非常重要（甲醇，乙腈和 THF 是常用的有機(jī)溶劑）
在有緩沖液的情況下, 緩沖液的濃度和pH值非常重要
增加流動(dòng)相極性：
固定相極性變化對(duì)分離的影響：
固定相極性變化對(duì)分離的影響：
離子對(duì)色譜
離子對(duì)試劑
•陰離子化合物：氫氧化四丁基銨、溴化四丁基銨
•陽(yáng)離子化合物：丁烷基磺酸鈉(C4)、戊烷基磺酸鈉(C5)、己烷基磺酸鈉(C6）、庚烷基磺酸鈉(C7)、辛烷基磺酸鈉(C8)、癸烷基磺酸鈉(C10)、十二烷基磺酸鈉(SDS)
離子對(duì)色譜影響因素
•離子對(duì)試劑的類(lèi)型
•離子對(duì)試劑的濃度
•流動(dòng)相的pH
正相色譜
色譜柱：
•硅膠柱:常用
•氰基柱: 常用
•氨基柱: 分析糖
•二醇基柱: 分析蛋白質(zhì)
相互作用力
氫鍵力
•如果樣品有
–-COOH: 羧基
–-NH2: 氨基
–-OH: 羥基
則氫鍵力強(qiáng).
•如果樣品沒(méi)有任何官能團(tuán)，象碳水化合物
•如果樣品有大的基團(tuán), 由于空間障礙
則氫鍵力弱.
正相模式下流動(dòng)相的選擇：
•主要試劑：烷烴(戊烷, 己烷, 庚烷, 辛烷)、芳香烴(苯, 甲苯, 二甲苯)、二氯甲烷–氯仿、四氯化碳
•輔助試劑：甲基-t-丁基醚(MTBE)、四氫呋喃(THF)、二氧雜環(huán)乙烷、嘧啶、乙酸乙酯、乙腈、丙酮、異丙醇、乙醇、甲醇
為了調(diào)整保留時(shí)間，可以選擇主要試劑然后再加入輔助試劑。
增加流動(dòng)相極性：
反相色譜與正相色譜的對(duì)比：
反相：保留時(shí)間重復(fù)性好、固定相耐用
正相：對(duì)立體異構(gòu)體有很好的分離(Vitamin E等)、保留時(shí)間重復(fù)性稍差
離子交換色譜：
離子交換色譜應(yīng)用：
生物領(lǐng)域(蛋白質(zhì), 農(nóng)藥, 氨基酸分析)
離子分析
陽(yáng)離子交換劑：強(qiáng)陽(yáng)離子交換劑(SCX)(R-SO3-)
弱陽(yáng)離子交換劑(WCX) (R-COO-)
陰離子交換劑：強(qiáng)陰離子交換劑(SAX) (R4N+)
弱陰離子交換劑(WAX)(DEAE)
尺寸排阻色譜法（SEC）
**部分 柱子基本性能參數(shù)
1、表征色譜柱的參數(shù)
硅膠純度：填料硅膠的純度與殘留金屬離子濃度。
色譜柱尺寸：填料床的長(zhǎng)度和內(nèi)徑。
顆粒形狀：球型或不規(guī)則型。
粒徑：平均顆粒直徑,通常3-10μm。
表面積：顆粒外表面和內(nèi)部孔表面的總和,以m2/g表示。
孔徑：顆粒的孔或腔的平均尺寸,范圍80-300Å。
碳百分率：與基體物質(zhì)相連的鍵合相的量。
封尾：用短鏈將裸露的硅羥基鍵合后封閉起來(lái)。
2、表征色譜柱性能的參數(shù)
（1）容量因子, k'
（2）理論塔板數(shù), N
（3）分離度, Resolution
完全分離時(shí)的分離度
（4）拖尾因子，T
第三部分 HPLC硬件基礎(chǔ)知識(shí)
1、液相色譜簡(jiǎn)易流程圖
2、流動(dòng)相的選擇
（1）采用“HPLC”級(jí)溶劑
（2）避免使用會(huì)引起柱效損失或保留特性變化的溶劑
（3）對(duì)試樣有適宜的溶解度
（4）溶劑粘度要小
（5）與檢測(cè)器相匹配
水的等級(jí)
HPLC用水可以通過(guò)以下幾個(gè)方法得到：
（1）專(zhuān)門(mén)的純水機(jī)或超純水機(jī):理想的HPLC用水應(yīng)為18.2MΩ的超純水，并通過(guò)0.22μm的濾膜，除去熱源、有機(jī)物、無(wú)機(jī)離子等。
（2）去離子水重蒸；
（3）二次或三次重蒸水；
不管采用何種途徑，配制流動(dòng)相應(yīng)用新鮮水。
有機(jī)溶劑的等級(jí)
應(yīng)選用HPLC級(jí)的有機(jī)溶劑。
緩沖鹽
選擇緩沖液的步驟：
1、確定*佳分離狀態(tài)時(shí)的流動(dòng)相pH
2、選擇具有與流動(dòng)相pH相近的pKa的緩沖液（即使?jié)舛认∫簿哂休^強(qiáng)能力的緩沖液）
3、確認(rèn)檢測(cè)波長(zhǎng)下緩沖液是否有大的吸收（在波長(zhǎng)210nm附近進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，不能用醋酸和檸檬酸的緩沖液）
緩沖液的使用：
（1）使用前必須過(guò)濾。
（2）使用后一定要進(jìn)行清洗，以免造成腐蝕、磨損、阻塞:用含5%甲醇 的水溶液沖洗30min（1ml/min），再用甲醇沖洗30min。
（3）用純水沖洗泵頭清洗管路。
（4）易受到**和霉菌的影響。
流動(dòng)相的更換
不互溶的流動(dòng)相不能直接更換，緩沖鹽不能直接用有機(jī)溶劑更換
溶劑的黏度
（1）乙腈黏度低在相同流速時(shí)有較低的柱壓。
（2）當(dāng)和水混合時(shí)黏度有變化柱壓也相應(yīng)有變化。
溶劑前處理
過(guò)濾
過(guò)濾：0.45um或更小孔徑濾膜目的：除去溶劑中的微小顆粒，避免堵塞色譜柱，尤其是使用無(wú)機(jī)鹽配制的緩沖液時(shí)。
濾膜類(lèi)型：
聚四氟乙烯濾膜：適用于所有溶劑，酸和鹽。
醋酸纖維濾膜：不適用于有機(jī)溶劑，特別適用于水基溶劑。
尼龍66濾膜：適用于絕大多數(shù)有機(jī)溶劑和水溶液，可以用于強(qiáng)酸，不適用于二甲基甲酰胺。
再生纖維素濾膜：蛋白吸收低，同樣適用于水溶性樣品和有機(jī)溶劑。
脫氣
脫氣：除去流動(dòng)相中溶解或因混合而產(chǎn)生的氣泡
氣泡對(duì)測(cè)定的影響：
（1）泵中氣泡使液流波動(dòng)，改變保留時(shí)間和峰面積
（2）柱中氣泡使流動(dòng)相繞流，峰變形
（3）檢測(cè)器中的氣泡產(chǎn)生基線波動(dòng)
脫氣方法：
1、超聲脫氣
2、減壓脫氣
3、在線脫氣
3、樣品前處理
（1）使用流動(dòng)相溶解樣品
--減少溶劑峰，尤其是組分峰靠近溶劑峰時(shí)尤為重要
--保證樣品在流動(dòng)相中的溶解度，避免樣品在系統(tǒng)中，
尤其在柱中產(chǎn)生沉淀
（2）進(jìn)樣前*好使用0.45um 的濾膜進(jìn)行過(guò)濾，
如果樣品很臟，要使用0.22um的濾膜進(jìn)行過(guò)濾。
（3）對(duì)于含有復(fù)雜基質(zhì)的樣品，*好前處理后再進(jìn)樣。
4、進(jìn)樣
（1）進(jìn)樣器
•自動(dòng)進(jìn)樣器
•手動(dòng)進(jìn)樣器原理：（六通閥）注入方式：1）全量注入2）部分注入
（2）手動(dòng)進(jìn)樣器的原理圖
•部分注入：一般要求進(jìn)樣量*多為定量環(huán)體積的一半，如20μl的定量環(huán)*多進(jìn)樣10μl的樣品，并且要求每次進(jìn)樣體積準(zhǔn)確、相同。
•全量注入：進(jìn)樣量*少為定量環(huán)體積的3至5倍，即20μl的定量環(huán)*少進(jìn)樣60至100μl的樣品，這樣才能完全置換樣品定量環(huán)內(nèi)殘留的溶液，達(dá)到所要求的精密度及重現(xiàn)性。
5、洗脫
（1）等度洗脫
（2）梯度洗脫
使用梯度洗脫的原因：
梯度洗脫要點(diǎn)：
梯度洗脫：
優(yōu)點(diǎn)：可提高分離度、縮短分離時(shí)間、降低*小檢測(cè)量和提高分離精度
注意事項(xiàng)：
（1）溶劑的純度要高，否則梯度洗脫的重現(xiàn)性差。
（2）梯度混合的溶劑互溶性要好。
（3）梯度洗脫應(yīng)使用對(duì)流動(dòng)相組成變化不敏感的選擇性檢測(cè)器（如
紫外吸收檢測(cè)器或熒光檢測(cè)器），而不能使用對(duì)流動(dòng)相組成變
化敏感的通用型檢測(cè)器（如示差折光檢測(cè)器）。
（4）查看空白實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)。
（5）遵守分析周期（*初的分析數(shù)據(jù)不采用）。
6、色譜柱的類(lèi)型及適用范圍
7、分析柱的維護(hù)
1、在使用新柱之前，*好用強(qiáng)溶劑在低流量下(0.2-0.3 ml/min)沖洗30 min，長(zhǎng)時(shí)間未用的分析柱也要同樣處理。
2、定期使用強(qiáng)溶劑沖洗柱子。
3、使用緩沖鹽時(shí)，要先用含5%甲醇的水溶液沖洗，再用有機(jī)溶劑沖洗。
4、凈化樣品。
5、分離條件。
6、不使用時(shí)，要蓋上蓋子，避免固定相干涸。
8、常用檢測(cè)器
（1）紫外檢測(cè)器（包括二極管陣列檢測(cè)器）
（2）熒光檢測(cè)器
（3）示差折光檢測(cè)器
（4）電導(dǎo)檢測(cè)器
（5）蒸發(fā)光散射檢測(cè)器
（6）質(zhì)譜檢測(cè)器
公安機(jī)關(guān)備案號(hào)：
