實驗流程：

從細(xì)胞材料中提取 RNA→RNA 加入到含有逆轉(zhuǎn)錄酶、引物、dNTPs 的反應(yīng)體系中→退火，引物與 RNA 鏈配對→延伸，逆轉(zhuǎn)錄酶合成互補(bǔ) cDNA 鏈變性→常規(guī) PCR 反應(yīng)流程（變性、退火、延伸，如此多次循環(huán)）。

RT-PCR“兩步法"與“一步法"：

RT-PCR 的實驗操作分為“一步法"與“兩步法"兩種。一步法 RT-PCR 能克隆微量 mRNA 而不需構(gòu)建 cDNA 文庫（即 cDNA 合成與 PCR 反應(yīng)在同一 Buffer 及酶中進(jìn)行，一步法完成），省略了 cDNA 與 PCR 之間的過程。兩步法 RT-PCR 首先用反轉(zhuǎn)錄酶合成 cDNA，然后以 cDNA 為模板進(jìn)行 PCR，即 RNA 反轉(zhuǎn)錄與 PCR 擴(kuò)增分兩步進(jìn)行。一步法 RT-PCR 與兩步法相比快速、簡便、減少了污染機(jī)會、減少了 RNA 二級結(jié)構(gòu)、減少了 PCR 反應(yīng)的錯配率。RT-PCR 兩步法的優(yōu)勢在于存在中間產(chǎn)物 cDNA，便于保存；且第2步 PCR 只取逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物的 1/10 進(jìn)行反應(yīng)，有利于 PCR 條件的調(diào)整，實驗重現(xiàn)性強(qiáng)；兩步法可以在第2步 PCR 反應(yīng)體系中加入特異性引物，其靈敏度比一步法高；兩步法的實驗預(yù)算要低于一步法。但是由于兩步法包括第1鏈 cDNA 合成和隨后的 PCR 反應(yīng)，容易產(chǎn)生污染問題。

實驗操作注意事項：

1、RNA 提取一定要迅速，樣本要新鮮，組織盡量在液氮中研磨；

2、 RNA 提取完馬上進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄不要拖延，新提的 RNA 很容易降解； 

3、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)過程，需建立無 RNAase 環(huán)境，以避免模板 RNA 降解； 

注：

  RNase 是 RNA 水解酶的統(tǒng)稱，包含 RNase A，RNase H 等，RNase A 可以水解單雙鏈 RNA，RNase H 主要水解 RNA 與 DNA 雜交雙鏈中的 RNA。