冷凍保存細胞之方法？

冷凍保存方法一: 冷凍管置于4℃ 30~60 分鐘→ （-20 ℃30 分鐘） → -80 ℃16~18 小時（或隔夜） → 液氮槽vaporphase 長期儲存。

冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設(shè)定程序之可程序降溫機中每分鐘降1-3 ℃ 至–80 ℃ 以下， 再放入液氮槽vapor phase長期儲存。*-20 ℃不可超過1 小時， 以防止冰晶過大，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80℃ 冰箱中，惟存活率稍微降低一些。

產(chǎn)品名稱：肝癌細胞；BEL-7402
形態(tài)特性：上皮樣

生長特性：貼壁生長

BEL-7402細胞株是1974年從臨床肝癌手術(shù)標本中建立的。細胞群體倍增時間為20小時。移植到處理過的wistar大鼠中的能形成腫瘤結(jié)節(jié)。細胞形態(tài)呈上皮樣細胞。在電子顯微鏡下亦顯示上皮細胞所具有的橋粒和張力原纖維，與臨床肝癌細胞相似。分瓶培養(yǎng)第四天時，其有絲分裂指數(shù)約為7%。BEL-7402細胞的染色體數(shù)為不足三倍體，有一個異常的近端著絲點染色體。間接熒光法測BEL-7402細胞內(nèi)的AFP為陽性反應(yīng)。LDH同工酶譜顯示與成年人肝細胞不同，而與人胚肝及臨床肝癌相近。

培養(yǎng)條件：RPMI1640+10%FBS

傳代方法：消化CQ-5分鐘，1:2,3天內(nèi)可長滿

培養(yǎng)操作：

1）復蘇細胞：將含有 1mL 細胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍，加 入 4mL 培養(yǎng)基混合均 勻。在 1000RPM 條件下離心 4 分鐘，棄去上清液，補 加 1-2mL 培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培 養(yǎng)過夜（或?qū)?細胞懸液加入 10cm 皿中，加入約 8ml 培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。天換液并檢查細胞密度。

2）細胞傳代：如果細胞密度達 80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。      

1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的 PBS 潤洗細胞 1-2 次。

2. 加 1ml 消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于 37℃培 養(yǎng)箱中消化 1-2 分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消 化。  

3. 按 6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在 1000RPM 條件下離心 4 分 鐘，棄去上清液，補加 1-2mL 培養(yǎng)液后吹勻。

4. 將細胞懸液按 1：2 比例分到新的含 8ml 培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

3）細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。下面 T25 瓶為類；

1. 細胞凍存時，棄去培養(yǎng)基后，PBS 清洗一遍后加入 1ml 胰酶，細胞變圓 脫 落后，加入 1ml 含血清的培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計數(shù)板計數(shù)。

2. 4 min 1000rpm 離心去掉上清。加 1ml 血清重懸細胞，根據(jù)細胞數(shù)量加 入血 清和 DMSO，輕輕混勻，DMSO 終濃度為 10%，細胞密度不低于1x106/ml，每支凍存管凍存 1ml 細胞懸液，注意凍 存管做好標識。

3. 將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80 度冰箱，2 個小時以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取.

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化蛋白酪氨激酶JAK-2Elisa試劑盒Alexa Fluor 350標記的兔抗小鼠k鏈Myf6  生肌調(diào)節(jié)因子6抗體

髓觸發(fā)受體2Elisa試劑盒PE-Cy3標記的兔抗小鼠k鏈MYF5  生肌決定因子Myf5抗體

白血病抑制因子受體Elisa試劑盒Cy7標記的兔抗大鼠IgGMyelin Protein Zero  外周髓脂P0蛋白/P0蛋白抗體

固調(diào)節(jié)因子結(jié)合蛋白2Elisa試劑盒PE-Cy3標記的兔抗大鼠IgGMyelin PLP  髓酯髓鞘蛋白1抗體

周期素I2Elisa試劑盒PE-CY5標記的兔抗大鼠IgGMyD88  髓樣分化蛋白抗體

周期蛋白E2Elisa試劑盒APC標記的兔抗大鼠IgGMycobacterium human  人結(jié)核桿體蛋白抗體

C反應(yīng)蛋白單體Elisa試劑盒Alexa Fluor 555標記的兔抗大鼠IgGMycobacterium bovis  牛結(jié)核桿體蛋白抗體

雙烯雌酚Elisa試劑盒Alexa Fluor 647標記的兔抗大鼠IgGMycobacterium  結(jié)核分枝桿抗體
細胞培養(yǎng)的優(yōu)點：

1.研究的對象是活細胞

在實驗過程中，根據(jù)要求可始終保持細胞活力，并可長時間監(jiān)控、檢測甚至定量評估一部分活細胞的情況，包括活細胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生命活動等。

2.研究條件可以人為控制

pH、溫度、氧氣、二氧化碳、張力等物理化學的條件，可以根據(jù)實際需要進行人為的控制，同時，可以施加化學、物理、生物等因素作為條件而進行實驗觀察，這些因素同樣可以處于嚴格控制之下。

3.研究的樣本可以達到比較均一性

通過細胞培養(yǎng)一定代數(shù)后，所得到的細胞系則可以達到均一性而屬于同一類型的細胞，需要時，可采用克隆化等方法使細胞達到純化。
4.研究內(nèi)容便于觀察、檢測和記錄采用各種研究技術(shù)：如倒置生物顯微鏡、熒光顯微鏡、電子顯微鏡、流式細胞術(shù)、激光共焦顯微鏡、組織化學、原位雜交、同位素標記等各種儀器備。

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