操作流程:
1.從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。
2.設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL；
3.樣本孔中加入待測樣本50μL；空白孔不加。
4.除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
5.棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次（也可用洗板機洗板）。
6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
7.每孔加入終止液50μL，15min內，在450nm波長處測定各孔的OD值。
產品特點：
1、公司產品僅用于科研不需要單獨純化線粒體，柱式法純化，操作簡單快捷。
2、得到的mtDNA可以直接用于PCR和酶切。
3、每107個動物細胞一般能得到100ng左右的mtDNA，每克組織一般能得到3～5μg mtDNA。
注意：本產品只適合于動物材料，不適合于植物材料，因為植物線粒體DNA一般都十分巨大,非常難提。
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產品名稱
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菜豆莢斑駁病毒RT-PCR試劑盒
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規(guī)格
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50次
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貨號
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FS-01P98630
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產品組成:
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成分
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規(guī)格
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溶液A
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13ml
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溶液B
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13ml
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溶液C
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18ml
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離心吸附柱
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50套
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通用洗柱液
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50ml
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DNA洗脫液
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10ml
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說明書
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1份
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使用方法:
一:培養(yǎng)細胞預處理
1. 用自備的0.25%胰酶消化液處理約107個培養(yǎng)細胞,離心收集后棄上清。
2. 用PBS或TBS等緩沖液洗滌細胞兩次,離心得到的細胞沉淀直接用于mtDNA提取。
二:組織細胞預處理
3. 用剪刀將1g新鮮的動物組織剪碎(芝麻大小*),轉移到1.5mL塑料離心管中,用于mtDNA提取。注意:*不要使用凍存的動物組織,因為凍凝過程中形成的冰晶會將線粒體刺破,使其DNA釋放出來被胞漿中的DNA酶降解,影響回收率。
三:血液預處理
4. 將3-5mL抗凝外周血靜置30分鐘或低速離心5分鐘,取白細胞層。
5. 用自備PBS洗滌白細胞兩次,得到的白細胞沉淀用于mtDNA提取。
柱式動物線粒體DNA提取試劑盒(PCR級)四:mtDNA提取
5.在細胞沉淀或剪碎的組織中加入250μL冰浴的溶液A,充分吹打分散。如果是剪碎的組織,不要等成塊的組織溶解即可繼續(xù)下步操作。
6. 加入250μL常溫的溶液B(如果溶液B有沉淀,用前須37℃加熱溶解后冷卻到室溫方可使用),溫和反復顛倒混勻10次。千萬不要劇烈振蕩。
7. 冰上放置6-8分鐘。注意不要超過8分鐘。
8. 加入350μL冰浴的溶液C,溫和混勻4-6次,可見白色沉淀物產生,然后放冰上放置20-25分鐘。
9.室溫12000~15000g離心10分鐘,小心將上清液轉移到離心吸附柱中。由于此時的溶液比重較大,有時候出現(xiàn)沉淀漂浮是正常現(xiàn)象,取上清時避開漂浮的沉淀即可。
10. 靜置5分鐘以讓DNA與離心吸附柱充分結合,此步十分重要。
11.室溫12000~15000g離心1分鐘,棄收集管中的廢液。
12. 加入500μL的通用洗柱液,室溫12000~15000g離心1分鐘,棄收集管中廢液。
注意:通用洗柱液中含乙醇,用后需要將蓋擰緊存放,否則乙醇會揮發(fā)。
13. 重復上步1次。
14.室溫12000~15000g離心1分鐘,甩干殘留液體。此步不能省略,否則殘留乙醇會影響DNA的后續(xù)使用(如DNA上樣時不能沉淀到加樣孔中)。
15. 將離心吸附柱置于一個新的1.5mL塑料離心管中,加入30-50μL 65-80℃預熱的DNA洗脫液,室溫放置2分鐘。常溫的DNA洗脫液也可以用于洗脫,但產量稍微有所降低。
16.室溫12000~15000g離心1分鐘,離心管底溶液即mtDNA。
17. 由于本公司離心吸附柱結合DNA能力較強,如果再加30-50μL DNA洗脫液到離心吸附柱中,往往還能洗脫下很多mtDNA(相當于次洗脫的20-30%),但注意不要使用上步得到的mtDNA溶液來洗脫。
18. 12000~15000g離心1分鐘,離心管底溶液即線粒體DNA。每107個動物細胞一般能得到100ng左右的mtDNA,每克組織一般能得到3-5μg mtDNA。如果DNA需要濃縮,可以使用本公司的核酸濃縮劑。
19. 由于DNA機械斷裂,電泳時DNA可能不呈現(xiàn)專一的帶,但此mtDNA溶液可以直接用于PCR。下列是公司正熱銷的產品：
TNF BETA蛋白表達西方雜交分析試劑盒5次Fmoc-L-天冬酰
TNF BETA蛋白共沉淀分析試劑盒5次開環(huán)異落葉松樹脂酚 Secoisolariciresinol
TNF BETA蛋白表達ELISA定量檢測試劑盒25次人布魯氏菌抗體IgG（Brucella Ab IgG）ELISA試劑盒,Brucella Ab I
載玻片細胞NF KAPPA B P65蛋白表達熒光顯微鏡檢測試劑盒10/20次人游離甲狀腺素（FT4）ELISA試劑盒,FT4 ELISA
冰凍切片組織NF KAPPA B P65蛋白表達熒光顯微鏡檢測試劑盒10/20次人1,5-脫水葡萄糖醇/1,5-脫水山梨（1,5-AG）ELISA試劑盒,1,5-AG ELISA
石蠟切片組織NF KAPPA B P65蛋白表達熒光顯微鏡檢測試劑盒10/20次人尿嘧啶核苷磷酸化酶1（UPP1）ELISA試劑盒,UPP1 ELISA
載玻片細胞NF KAPPA B P65蛋白表達NBT顯色光學顯微鏡檢測試劑盒10/20次人N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAG）ELISA試劑盒,
冰凍切片組織NF KAPPA B P65蛋白表達NBT顯色光學顯微鏡檢測試劑盒10/20次人L-乳酸脫氫酶（L-LDH）ELISA試劑盒,
石蠟切片組織NF KAPPA B P65蛋白表達NBT顯色光學顯微鏡檢測試劑盒10/20次人球蛋白E（IgE）ELISA試劑盒,
細胞NF KAPPA B P65蛋白表達比色法定量檢測試劑盒10/50 次人不透光相關蛋白（OPAs）ELISA試劑盒,
細胞NF KAPPA B P65蛋白表達熒光定量檢測試劑盒10/50 次小鼠葡萄糖依賴性胰島素釋放多肽（GIP）ELISA試劑盒,
NF KAPPA B P65蛋白表達西方雜交分析試劑盒5次大鼠L-鼠乳酸脫氫酶（L-LDH） ELISA試劑盒,
NF KAPPA B P65蛋白共沉淀分析試劑盒5次大鼠脂多糖結合蛋白（LBP）ELISA試劑盒,
NF KAPPA B P65蛋白表達ELISA定量檢測試劑盒25次大鼠Toll樣受體4（TLR4）ELISA試劑盒,
細胞NF KAPPA B P50蛋白表達流式細胞儀檢測試劑盒10/20次大鼠游離前列腺特異性抗原（fPSA）ELISA試劑盒,
菜豆莢斑駁病毒RT-PCR試劑盒DACH2 轉錄調節(jié)因子DACH2抗體正癸 98%
DARPP32 多巴、cAMP調節(jié)磷蛋白抗體琥珀酸二乙酯 98%
Phospho-DARPP32 (Thr34) 磷酸化多巴/cAMP調節(jié)神經磷蛋白抗體琥珀酸二乙酯 99%
Phospho-DARPP32 (Thr75) 磷酸化多巴/cAMP調節(jié)磷蛋白抗體琥珀酸二乙酯 standard for GC, ≥99.6% (GC)
DRD1 多巴受體D1抗體癸二酸二乙酯 98%
DRD2 多巴受體D2抗體癸二酸二乙酯 standard for GC
DRD3 多巴受體D3抗體癸 97%
DAT1 多巴轉運蛋白抗體癸 ≥95%, FCC, Kosher
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