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規(guī)格
產(chǎn)品名稱
A-PJ1109-1 kit
1 kit
pCold-SUMO-10His原核蛋白表達試劑盒
產(chǎn)品介紹:
pCold-SUMO-10His原核蛋白表達試劑盒本試劑盒所包含的原核表達載體(pCold-SUMO-10His)是在 pCold-SUMO 載體基礎(chǔ)上改造而成( **), 該載體啟動子(CS Promoter)來源于南極嗜冷**,在低溫下(15 度)才能啟動蛋白的表達。低溫下**生長緩慢,使得蛋白合成速度減慢,從而*大限度的提高了蛋白正確折疊的幾率,提高了蛋白可溶性表達,增強了活性蛋白的表達比率。該表達系統(tǒng)所包含的 SUMO tag 可以極大地提高小分子量蛋白的表達量,而且進一步提高了蛋白的可溶表達幾率。同時,TEE 信號肽可增強冷啟動子調(diào)控下目的蛋白的高表達。 改進后的 pCold-SUMO-10His 載體,其 SUMO 蛋白標(biāo)簽含有 10 個組氨酸標(biāo)簽(10His tag),使其結(jié)合 Ni-NTA 的能力更強。與較早版本的 pCold-SUMO 表達系統(tǒng)相比,pCold-SUMO-10His 表達系統(tǒng)在保留了原有統(tǒng)的蛋白可溶性能**能力、高特異性剪切能力的情況下,對 Ni-NTA 結(jié)合能力的得到明顯提高。其對 Ni-NTA 結(jié)合能力的提高, 在以下三個方面改善了**重組蛋白的性能: (1)提高了粗蛋白樣品中目標(biāo)蛋白的捕獲能力,從而提高純化產(chǎn)量; (2)在蛋白純化過程中可以 使用更高濃度的咪唑進行漂洗,去雜蛋白的能力明顯提升,從而獲得更高純度的重組蛋白; (3)在重組蛋白酶切去除 SUMO標(biāo)簽后,利用 Ni-NTA 去除 SUMO 標(biāo)簽更為徹底,獲得純度更高的無標(biāo)簽?zāi)繕?biāo)蛋白。 關(guān)于宿主菌的使用:本試劑盒配備了兩種宿主表達菌感受態(tài)細(xì)胞,Lyophilized Arctic (DE3)感受態(tài)和 LyophilizedBL21(DE3) Chaprone 感受態(tài),兩種感受態(tài)均為凍干品形式可長期保存在-20℃,效價無明顯下降(2~10X10e5 cfu/μg)。 通常在質(zhì)粒載體的構(gòu)建完成,并測序驗證后,可將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入該感受態(tài)進行蛋白表達。該宿主菌僅為蛋白表達**用,不可以進行載體構(gòu)建和質(zhì)粒的提取制備。由于 pCold-SUMO 系???的高可溶性表達特性,在大多數(shù)情況下重組蛋白在 LyophilizedArctic (DE3)感受態(tài)即可獲得理想的可溶表達,因此**實驗請選用 Lyophilized Arctic (DE3)感受態(tài)宿主菌。 在 LyophilizedArctic (DE3)感受態(tài)宿主菌可溶表達效果不理想的情況下,再選用操作相對復(fù)雜的、帶有輔助折疊伴侶分子的 LyophilizedBL21(DE3)Chaprone 宿主菌,該系統(tǒng)可獲得*佳的可溶表達。除此外,pCold-SUMO 系統(tǒng)在常規(guī) BL21(DE3)、BL21(DE3)plys等宿主菌內(nèi)均可獲得可觀的可溶性表達。 關(guān)于蛋白酶的使用:試劑盒配備了 SUMO 蛋白酶(酵母來源,也稱為 UIP 蛋白酶)和 rTEV 蛋白酶,在**步載體構(gòu)建過程中需要評估、考慮兩個蛋白酶的使用策略。SUMO 蛋白酶識別蛋白結(jié)構(gòu),切割活性高、酶切完全,對于需要去除 Tag的重組蛋白其是優(yōu)選。個別情況下 SUMO 標(biāo)簽的結(jié)構(gòu)會受到 C 端重組目標(biāo)蛋白的影響,使得 SUMO 蛋白酶對重組融合蛋白的切割效率降低、甚至是無效,此時再選用 rTEV 蛋白酶進行酶切。由于 rTEV 蛋白酶識別氨基酸序列,個別重組融合蛋白會包埋識別序列,因此也會導(dǎo)致蛋白酶切效率下降。由于重組融合蛋白結(jié)構(gòu)的無法預(yù)測性,因此在實驗過程中兩種蛋白酶的酶切均需要測試。無論如何,通常 SUMO 蛋白酶具有更高的效率,是優(yōu)選。本試劑盒配備的 SUMO 蛋白酶可以識別 SUMO標(biāo)簽結(jié)構(gòu)(SDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQGKEMDSLRFLYDGIRIQADQTPEDLDMEDNDIIEAHREQIGG)切割位點位于 QIGG 之后。SUMO 蛋白酶含有雙 His 標(biāo)簽,保證了 SUMO 蛋白酶高親力的結(jié)合 Ni-NTA,以*大限度的去除 SUMO 蛋白酶(分子量約 26kD)。rTEV 蛋白酶可以識別 SUMO 標(biāo)簽后面的 Glu-AsnLeu-Tyr-Phe-Gln-Gly (ENLYFQG)氨基酸序列,并在識別位點 Gln-Gly(QG)之間進行切割,從而去除 SUMO 標(biāo)簽。rTEV 蛋白酶含有 6XHis 標(biāo)簽(分子量約 30kD),可使用 Ni-NTA 純化介質(zhì)去除。 本試劑盒配備的 pCold-SUMO-10His-Positive Plasmid 為蛋白表達陽性質(zhì)粒,該質(zhì)粒含有 43kD 的目標(biāo)蛋白,其與SUMO 標(biāo)簽(19kD)融合后分子量約為 62kD。該表達質(zhì)粒在 Arctic (DE3)中即可獲得良好的表達。其可以僅可做為表達、酶切實驗的陽性對照品。
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