嵌合抗原受體T細(xì)胞免役療法（CAR-T） 是將嵌合抗原受體（CARs） 導(dǎo)入T 細(xì)胞，通過對癌細(xì)胞表面抗原進(jìn)行特異性識別達(dá)到對癌細(xì)胞特異性殺傷效果，從而實(shí)現(xiàn)對癌癥的特異性治遼。目前在急性林巴細(xì)胞白血?。ˋLL）、非霍奇金林巴瘤（NHL）、多發(fā)性骨髓瘤（MM）等血液學(xué)惡性腫瘤患者中顯示出****的治瑜率。隨著兩款靶向CD19的CAR-T細(xì)胞（Kymriah，Yescarta）被FDA批準(zhǔn)用于治遼B-ALL和DLBCL，CAR-T細(xì)胞治遼技術(shù)正在向綜合治遼方案以及其他惡性腫瘤適應(yīng)癥方面探索。
CAR-T機(jī)制
CAR-T細(xì)胞的制備：首先從患者身上分離出外周血林巴細(xì)胞，然后選擇性的擴(kuò)增其中的T細(xì)胞。一般來說，T細(xì)胞可以在10-42天內(nèi)擴(kuò)增100-1000倍。靶向目標(biāo)抗原的基因序列，將在擴(kuò)增過程的早期**入T細(xì)胞。隨后，T細(xì)胞將在細(xì)胞表面表達(dá)CAR分子，結(jié)構(gòu)上包括胞外抗原結(jié)合域、跨膜錨定域和細(xì)胞內(nèi)信號域（圖1）。
a.從患者體內(nèi)獲取一定量的血液，加入抗凝劑防止血液凝固，用白細(xì)胞分離術(shù)以除去血液中的血小板和紅細(xì)胞，獲得外周血單核細(xì)胞（PBMC)；b. 從PBMC 中分離出CD4陽性T細(xì)胞和CD8陽性T細(xì)胞，通過進(jìn)一步富集確保分離的T細(xì)胞中不含非林巴細(xì)胞并在一定條件下進(jìn)行體外培養(yǎng)，利用IL-2、CD3等激活T細(xì)胞；c.利用電穿孔、慢病毒載體等方法將CAR的mRNA或DNA導(dǎo)入T細(xì)胞，mRNA在胞質(zhì)中經(jīng)核糖體翻譯后表達(dá)CAR，DNA通過整合到T細(xì)胞的基因組中使T 細(xì)胞能夠表達(dá)CAR；d. 對獲得的CAR-T 細(xì)胞進(jìn)行免役分型、存活力、內(nèi)**等方面的檢測，在確保生產(chǎn)的CAR-T細(xì)胞純度和**性后回輸給患者，實(shí)現(xiàn)CAR-T免役治遼。
CAR-T療法的治遼過程
CAR-T在實(shí)體瘤的發(fā)展
CAR-T治遼已經(jīng)在臨床上得到應(yīng)用，作為有效治遼腫瘤的方法之一，在血液瘤的治遼上體現(xiàn)出較好的療效，對實(shí)體瘤也體現(xiàn)出一定的治遼效果。 美國貝勒醫(yī)學(xué)院細(xì)胞和基因治遼中心在免役缺陷小鼠上建立HER2陽性的多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤（GBM） 異種移植模型并注射自體HER2 CART細(xì)胞，結(jié)果顯示：HER2CAR-T細(xì)胞能夠識別并消除源于HER2 陽性GBM的CD133 陽性與CD133陰性細(xì)胞，而HER2陰性的腫瘤細(xì)胞存活。這表明HER2 CAR-T細(xì)胞對HER2陽性腫瘤具有有效的抗腫瘤活性。此外，以碳酸酐酶-Ⅸ（CAⅨ）、神經(jīng)節(jié)苷脂（GD2）、白介素13受體α2 （IL13Rα2）和癌胚抗原（CEA） 為特異性位點(diǎn)的CAR-T已制備成功并用于轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和肝轉(zhuǎn)移瘤的治遼研究，以此探索CAR-T治遼的相關(guān)機(jī)制、療效以及**性。總的來說，全球目前已經(jīng)有至少22個(gè)靶點(diǎn)被陸續(xù)應(yīng)用于實(shí)體腫瘤的CAR-T治遼，部分研究已經(jīng)發(fā)表，部分仍在進(jìn)行中，包括：FR-α,CAIX, L1-CAM, MSLN, HER2, EGFR, EGFRvIII, IL13Rα2, CEA, GD2, MUC1, PSMA, PSCA,FAP, CD133, cMET, EphA2, GPC3, VEGFR-2, ROR1, EpCAM, MUC16。
按照器官分類的被考慮/試驗(yàn)的可能的實(shí)體腫瘤CAR-T細(xì)胞治遼靶點(diǎn)
CAR-T 療法雖然在血液瘤和實(shí)體瘤治遼中均取得了一定的成效，各種不同類型的CAR被設(shè)計(jì)，但是仍存在瓶頸難題有待突破.這些障礙包括：1. 脫靶毒性（on-target/off-tumor） 這是CAR-T治遼中亟待解決的問題。脫靶毒性表現(xiàn)為CAR-T細(xì)胞攻擊其他表達(dá)目標(biāo)抗原的正常細(xì)胞，使正常細(xì)胞死亡甚至對臟器造成損傷，嚴(yán)重時(shí)危及患者生命；2. 細(xì)胞因子釋放綜合征。CRS是CAR-T治遼后常見的毒副作用并且會由低等級的全身癥狀向高等級發(fā)展，癥狀嚴(yán)重時(shí)會產(chǎn)生呼吸窘迫綜合征，引起肝臟損傷以及血管內(nèi)凝血致命的臨床癥狀；3.實(shí)體瘤微環(huán)境中的有效激活；CAR-T對腫瘤的免役效果不明顯的原因之一是腫瘤微環(huán)境的存在。TME由腫瘤細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)、炎癥細(xì)胞以及基質(zhì)細(xì)胞等組成，影響腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。在CAR-T細(xì)胞免役腫瘤的過程中，腫瘤微環(huán)境通常阻止林巴細(xì)胞有效的啟動，阻礙效應(yīng)T細(xì)胞的浸潤，此外，已經(jīng)浸潤至腫瘤的細(xì)胞會受到腫瘤微環(huán)境的再次影響，引起CAR-T細(xì)胞的耗竭，導(dǎo)致宿主無法排斥腫瘤；4.人體內(nèi)CAR-T細(xì)胞的持久性。 盡管如此，CAR-T細(xì)胞療法仍然是復(fù)發(fā)和難治性惡性腫瘤的一個(gè)令人興奮的治遼選擇，使用CAR-T細(xì)胞療法治遼惡性實(shí)體腫瘤也出現(xiàn)了一些很好的結(jié)果。未來CAR-T細(xì)胞治遼實(shí)體腫瘤的研究應(yīng)側(cè)重于方法的創(chuàng)欣，以應(yīng)對實(shí)體腫瘤特有的挑戰(zhàn)。 CAR-T在其制備過程中可通過電穿孔、慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)，將CAR基因?qū)牖颊咦陨矸蛛x出的T細(xì)胞里使T細(xì)胞經(jīng)改造后能夠表達(dá)CAR基因. 但這三種方法具有各自的特點(diǎn)。
制備CAR-T細(xì)胞的三種方法的特點(diǎn)
電穿孔法采用直接將mRNA導(dǎo)入T 細(xì)胞實(shí)現(xiàn)CAR瞬時(shí)表達(dá)而且不存在基因組的整合，使得DNA誘變的可能性非常低。該方法制備的CAR-T在實(shí)體瘤的治遼中體現(xiàn)出一定的抗腫瘤活性。艾布拉姆森癌癥中心用電穿孔法制備靶向間皮素的CAR-T細(xì)胞，靜脈給藥后短暫存留于外周血并遷移至原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤位點(diǎn)，兩例病例報(bào)告中因其未出現(xiàn)明顯的脫靶毒性，證明了它的**性和可行性。賓夕法尼亞大學(xué)醫(yī)學(xué)院用電穿孔法制備CAR-T，通過多次注射成功使大血管化側(cè)腹間皮瘤出現(xiàn)消退的現(xiàn)象。Nicole Bidmon等人在2018年發(fā)表的文章中使用BTX電穿孔設(shè)備制備CAR-T，轉(zhuǎn)染效率達(dá)到了97.3%，活率達(dá)到了96%。
Performed by BTX Electroporator
Bidmon et al., 2018
BTX提供先進(jìn)的電穿孔解決方案，AgilePulse Max系統(tǒng)是專為大容量轉(zhuǎn)染而設(shè)計(jì)的，用于快速、高效地轉(zhuǎn)染20ul至10ml的細(xì)胞懸液。該系統(tǒng)簡單易用，可在電極杯、flatpack電擊室或者AgilepulseMax配備的大容量電擊室里完成細(xì)胞轉(zhuǎn)染。該系統(tǒng)還具有磚利的PulseAgile分段脈沖導(dǎo)入技術(shù)，首先通過一系列短而高強(qiáng)度脈沖增加細(xì)胞膜通透性，再利用低強(qiáng)度脈沖促進(jìn)質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)胞，PulseAgile的磚利技術(shù)在保證高效的基因?qū)胪瑫r(shí)，還能以很小的升熱量和很短的循環(huán)時(shí)間來醉大化提高細(xì)胞活性，以確保在進(jìn)一步的細(xì)胞處理中具有高的細(xì)胞存活率。因此AgilePulse Max成為高效快速制備CAR-T的選擇。
BTX AgilePulse Max
產(chǎn)品特性
獨(dú)特大體系轉(zhuǎn)染室
-可以一次性高效完成多至10ml樣品的轉(zhuǎn)染
獨(dú)特的轉(zhuǎn)染緩沖液
-CytoporationMedium T專業(yè)轉(zhuǎn)染液保證高的轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞存活率
觸摸屏設(shè)計(jì)
-觸摸屏設(shè)計(jì)，輕松設(shè)置參數(shù)
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