蜂毒明肽能提高 AD 小鼠認知功能，減少海馬 CA1 區(qū) Aβ25 － 35 的表達。

【關(guān)鍵詞】 蜂毒明肽; 阿爾茨海默病; 認知功能; β-淀粉樣蛋白; CA1 區(qū)，海馬回

中圖分類號: Ｒ 749. 1 + 6 文獻標識碼: A 文章編號: 1674 － 8182( 2014) 06 － 0644 － 03

阿爾茨海默病( Alzheimer' s  disease，AD) 作為一種臨床常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性**，主要表現(xiàn)為認知功能障礙。由于 AD 起病緩慢、病程長、病因復(fù)雜，目前尚無良好的****和方法。蜂毒明肽( apamin) 是一種神經(jīng)**，其作為蜂毒各組分中分子量*小的神經(jīng)毒肽是蜂毒中重要的活性物質(zhì)之一。研究認為，蜂毒明肽可提高正常鼠或海馬損傷鼠模型的空間記憶能力［1 － 2］，但對公認的 AD 動物模型的干預(yù)作用報道很少。本研究采用側(cè)腦室注射β-淀粉樣肽_{25 － 35} ( β- amyloid protein，Aβ_25 － 35 )  構(gòu)建 AD 小鼠模型，初步觀察蜂毒明肽對 AD 小鼠模型認知功能的影響，探討其作用機制，以期為 AD **尋找新的分子靶點提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1． 1 材料 蜂毒明肽由廈門市英偉生物技術(shù)有限公司提供。10 周齡健康昆明種雌性小鼠60 只，SPF 級，體重 ( 20 ± 2 ) g，購自廈門大學(xué)實驗 動物中心。Aβ_25 － 35 和 Aβ_25 － 35 抗體均購自上海華壹生物科技有限公司。即用型**組化超敏 SP 試劑盒和 DAB 顯色試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。 Morris 水迷宮。CCD 顯微成像系統(tǒng)。

1． 2 方法

1． 2． 1    動物分組及給藥    實驗小鼠 60 只適應(yīng)性飼養(yǎng) 1 周，按體質(zhì)量分層后隨機分為6 組( 每組10 只) : 正常對照組、假手術(shù)組、AD  模型組、蜂毒明肽低劑量組、蜂毒明肽中劑量組、蜂毒明肽高劑量組。正常對 照組小鼠不做任何處理，假手術(shù)組小鼠側(cè)腦室注射生 理鹽水，蜂毒明肽組和 AD 模型組小鼠進行側(cè)腦室注射 4 μl 濃度為 1 mg / ml 的 Aβ_{25 － 35} 溶液構(gòu)建 AD 動物模型。14 d 后，按 10 ml / kg 的劑量，分別給蜂毒明肽低、中、高劑量組小鼠腹腔注射濃度為 0． 006、0． 02、

0. 04 mg / ml 的蜂毒明肽溶液，其余組注射等體積的生理鹽水，連續(xù) 5 d。

2． 2     Morris 水迷宮法測定小鼠認知功能     造模 14 d后，每次腹腔注射蜂毒明肽 30 min 后進行水迷宮測試，平臺置于第Ⅳ象限距離池壁 35 cm 處，水面高出玻璃平臺約 2  cm，水溫控制在( 20 ± 2) ℃ 。測試前1 d將讓小鼠熟悉水池環(huán)境，先將小鼠放入水池中讓其自由游泳 2  min，隨后引導(dǎo)其至玻璃平臺停留 10 s。( 1) 定位航行實驗: 將小鼠隨機從不同的象限置入池內(nèi)，小鼠到達玻璃平臺上 5 s 后終止記錄，如果小鼠 60 s 內(nèi)仍然不能找到玻璃平臺，則將其引導(dǎo)到玻璃平臺上停留 5 s。每次測試四個象限，每一象限測試間隔 10 min。記錄逃避潛伏期，即小鼠找到玻璃平臺的時間，連續(xù)測試 4 d。( 2) 空間探索實驗: 第5 d 時撤掉玻璃平臺，隨機定位一個入水點，使得所有待測試小鼠均在該點進入水槽，記錄 60 s 內(nèi)小鼠在原目的象限內(nèi)停留時間和穿環(huán)次數(shù)即小鼠游經(jīng)原放置玻璃平臺位置的次數(shù)。

1． 2． 3 **組化 Morris 水迷宮實驗結(jié)束后，小鼠快速斷頭，取大腦，將腦組織在 4% 多聚甲醛磷酸鹽溶液中固定 24 h。于人字點前 3mm 處冠狀面取材。石蠟包埋后切片( 4 μm) ，常規(guī)脫蠟至水，微波修復(fù)抗原，SP  法**組化染色，DAB  顯色，蘇木素復(fù)染。 PBS 代替一抗做陰性對照。蛋白表達陽性部位呈有別于背景的棕黃色，判定為陽性。顯微圖像分析系統(tǒng) 分析并測定相對灰度值。

1. 3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用 SPSS 16． 0 統(tǒng)計軟件對實驗

數(shù)據(jù)進行分析。計量資料用 x珋± s 表示，組間比較采用 One-way  ANOVA，兩兩比較方差齊時用 LSD-t 檢驗，方差不齊時用 Games-Howell 檢驗。P ＜ 0． 05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 各組小鼠認知功能變化  Morris 水迷宮實驗檢測的各組小鼠認知功能變化結(jié)果見表 1、表 2。與正常對照組比較，蜂毒明肽各組和 AD 模型組小鼠的平均逃避潛伏期時間增長、目的象限停留時間減短、穿環(huán)次數(shù)有所減少( P 均 ＜ 0． 05) 。而假手術(shù)組小鼠的各項指標與正常對照組比較無統(tǒng)計學(xué)差異( P 均 ＞

0. 05) 。與 AD 模型組相比較，蜂毒明肽各劑量組小

鼠的平均逃避潛伏期有所縮短，目的象限停留時間有所延長，穿環(huán)次數(shù)有所增加，其中蜂毒明肽中劑量組和高劑量組變化明顯( P 均 ＜ 0． 05) 。

2． 2    各組小鼠海馬 CA1 區(qū) Aβ_25 － 35 的表達    Aβ_25 － 35

在腦組織神經(jīng)元中的表達主要定位于胞膜和胞質(zhì)中， 呈有別于背景的棕黃色。**組化結(jié)果顯示，正常對  照組與假手術(shù)組有少數(shù)淡黃色陽性染色顆粒，陽性表  達不明顯; 蜂毒明肽各組和 AD 模型組鏡下可見棕黃色強陽性染色顆粒。與 AD 模型組比較，蜂毒明肽各組 Aβ_{25 － 35} 的表達較弱。見圖 1。平均灰度值分析顯示，與正常對照組相比，蜂毒明肽組和 AD 模型組Aβ_25 － 35 表達有所增加( P均 ＜ 0 ． 05 ) ，而假手術(shù)組未見差異( P ＞ 0． 05) 。與 AD 模型組相比，蜂毒明肽各組小鼠海馬 CA1 區(qū) Aβ_{25 － 35} 的表達減少，其中蜂毒明肽中、高劑量組變化較明顯( P 均 ＜ 0． 05) 。見圖 2。

3 討論

AD 作為一種危害老年人身體健康的神經(jīng)系統(tǒng)**，給社會與患者家庭帶來沉重負擔(dān)。由于 AD 起病隱秘，病因復(fù)雜，到目前為止，臨床上尚缺乏有效的防治 AD 方法和**。Aβ 過度表達和沉積已被公認為是 AD 發(fā)生、發(fā)展的主要原因 ［3］。因此，如何減少Aβ 過度表達已經(jīng)成為防治 AD 研究的熱點之一。蜂毒明肽作為蜂毒中重要的多肽之一，約占蜂毒干質(zhì)重的 1% ～ 2% ，被認為是一種很強的神經(jīng)**，其可以通過血腦屏障，直接作用于**神經(jīng)系統(tǒng)［4 － 5］。張愛提等［6］對中華蜜蜂蜂毒明肽基因序列進行了生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)其存在較明顯的跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)和信號肽序列，具有生物**肽的特性。同時，研究發(fā)現(xiàn)蜂毒明肽可以通過調(diào)節(jié)機體內(nèi)腎上腺素或者改變細胞膜上的離子通道繼而提高認知功能［1 － 2］，但其對公認的 AD 模型動物干預(yù)作用國內(nèi)報道還很少見。

       本研究結(jié)果顯示，與正常對照組相比，AD 模型組小鼠的逃避潛伏期時間延長，在目標象限停留時間減少，穿越平臺的次數(shù)減少，海馬 CA1 區(qū)Aβ_{25 － 35} 表達增多。而采用蜂毒明肽干預(yù)的各組小鼠較 AD 模型組小鼠逃避潛伏期有所縮短，在目標象限停留時間有所延長，穿環(huán)次數(shù)增多，海馬 CA1 區(qū)Aβ_{25 － 35} 陽性表達減弱。說明蜂毒明肽能減少海馬CA1 區(qū)Aβ_{25 － 35} 的表達，繼而提高 AD 小鼠認知功能，改善 AD 病程，其分子機制可能與其特異性阻斷小電導(dǎo)鈣激活性鉀通道有關(guān)［7］。