關(guān)鍵詞:創(chuàng)傷性顱腦損傷; 丙戊酸; 大鼠; 神經(jīng)干細(xì)胞

中圖分類號(hào):  Ｒ394． 2    文獻(xiàn)標(biāo)志碼:  A    文章編號(hào):  1004-7239( 2016) 06-0469-04

丙戊酸( valproic  acid，VPA) 是目前臨床一線廣譜抗癲癇藥，在預(yù)防和控制癲癇發(fā)作中發(fā)揮著主要 作用。VPA 是分子量很小的短鏈脂肪酸，由 8 個(gè)碳原子和脂肪酸支鏈組成，能很好地透過血腦屏障。近年來有研究表明，VPA 在**腦卒中、阿爾茨海默病、帕金森病等神經(jīng)系統(tǒng)**中有顯著療效［1-4］。作者通過制作重型顱腦損傷大鼠模型，造模成功后給予 VPA 進(jìn)行干預(yù)，于不同時(shí)間點(diǎn)取材測(cè)定顱腦損傷大鼠腦組織中 5-乙炔基-2'-脫氧尿嘧啶核苷( 5-e- thynyl-2'- deoxyuridine，Edu) 細(xì)胞及巢蛋白( Nestin)陽性細(xì)胞的表達(dá)及其動(dòng)態(tài)變化，觀察 VPA 對(duì)顱腦損傷大鼠海馬成體神經(jīng)干細(xì)胞( neural  stem  cell，NSC)的原位激活作用。

1 材料與方法

1． 1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物    健康清潔級(jí)成年 Sprague-Dawley ( SD) 雄性大鼠 66 只，體質(zhì)量 250 ～ 300  g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào): SCXK ( 京 ) 2012-0001， 質(zhì) 量 合 格 證 號(hào) : 114。

1． 2主要試劑及儀器 鼠自由落體打擊器 ，Edu 組織切片試劑盒 ，VPA ，Nestin 單克隆抗體( 英國(guó) Abcam 公司) ，羊抗鼠熒光二抗、4'，6-二脒基-2-苯基吲哚( 4'，6- diamidino-2-phenylindole，DAPI)  染色反應(yīng)液(  美國(guó) Gene Copoeia 公司) ，BM-IX 型生物組織包埋機(jī)( 孝感市宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司) ，Shan Don Finesse 325型石蠟切片機(jī)，**熒光顯微鏡( ECLIPSE 55i，日本 Nikon) 。

1． 3動(dòng)物分組及模型制備 健康清潔級(jí)成年 SD雄性大鼠 66 只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組( n = 6) 、單純損傷組( n = 30) 和 VPA **組( n = 30) 。正常對(duì)照組大鼠不做任何處理; 單純損傷組、VPA **組大鼠以 Feeney 方法［5-6］制作顱腦損傷模型。將大鼠置于底座，固定頭部。質(zhì)量分?jǐn)?shù) 10% 水合氯醛麻醉， 剪去大鼠頂枕部毛發(fā)，常規(guī)**，在頂枕部的中線偏 右約 5 mm 處縱行切約 4 cm 切口，鈍性剝離軟組織和骨膜，充分暴露顱骨。在人字縫前 3 mm、顱骨中線旁 3 mm 處，鉆一直徑約 5 mm 的圓形骨孔，可見硬腦膜，注意保護(hù)其完整完好。大鼠自由落體打擊 器以 25 g 打擊錘從 20 cm 的高處自由落體打擊，造成大鼠閉合性顱腦損傷，成功后骨蠟封閉骨破損區(qū)， 縫合頭皮。術(shù)后 VPA **組大鼠給予腹腔注入VPA，按每天 300  mg·kg ^－ 1 的劑量經(jīng)腹腔注射給藥，連續(xù)給藥至處死當(dāng)天; 單純損傷組大鼠術(shù)后經(jīng)腹腔給予等量的生理鹽水; 術(shù)后將大鼠分籠飼養(yǎng)在動(dòng)物專用飼養(yǎng)室。

1． 4 造模大鼠行為學(xué)評(píng)分及入組標(biāo)準(zhǔn) 參照大鼠神經(jīng)功能評(píng)分( neurological  severity  scores，NSS) ［7］于術(shù)后第 1、4、7、14、21、28 天對(duì)各組大鼠神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)分。包括運(yùn)動(dòng)、感覺、反射及平衡能力 4 項(xiàng)， *高 18 分，*低 0 分。輕度損害: 1 ～ 6 分，中度損害: 7 ～ 12 分，重度損害: 13 ～ 18 分。入組標(biāo)準(zhǔn)為術(shù)后第 1 天評(píng)分 5 ～ 15 分。

1． 5取材與制片 按分組給予 Edu 標(biāo)記( 參照說明書) : 采用生理鹽水溶解 Edu 至 0． 5  g·L ^－ 1 ，按照 50  μg·kg ^－ 1 每只大鼠尾靜脈注射 20  μL，連續(xù)注射  2 d。將單純損傷組及 VPA **組大鼠分別在造模后第 3、7、14、21、28 d 分別取 6 只大鼠，質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% 水 合 氯 醛 麻 醉，先 用 肝 素 化 生 理 鹽 水10 U·mL ^－ 1 快速灌注，然后換 40 g·L ^－ 1 多聚甲醛灌注，至 肢體抽搐，斷 頭取腦，沖 xi腦表面積血， 40 g·L ^－ 1 多聚甲醛固定過夜，以視交叉為中心向后取 2 mm 厚的冠狀腦片，充分固定后常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋，用石蠟切片機(jī)制作厚5 μm 冠狀切片，每個(gè)標(biāo)本取 3 張片，行 Edu 及Nestin **熒光染色［8］。

1． 6 Edu 及 Nestin **熒光染色    采用 Edu 組織切片試劑盒進(jìn)行 Apollo 染色，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作，然后滴加 100 μL 1 × DAPI 染色反應(yīng)液，避光，室溫孵育 30 min 后，棄染色反應(yīng)液，無菌磷酸鹽緩沖液( phosphate buffered saline，PBS ) 清洗 1 ～ 3 次，洗脫 DAPI 反應(yīng)液，檢測(cè) Edu 陽性細(xì)胞。采用檸檬酸鹽抗原修復(fù)液進(jìn)行抗原修復(fù)后，PBS 清洗 1 ～ 3次，山羊血清 37  ℃ 封閉 30 ～ 60  min，抗 Nestin 抗體 1∶50 稀釋成工作濃度后孵育一抗，37 ℃ 作用30  min，0． 01  mol · L ^－ 1 磷酸鹽吐溫緩沖液(  phos- phate  buffered  saline  with  tween-20，PBST) 緩沖液震蕩漂洗 3 次，每次 5 min ，加 1∶1 000 羊抗鼠熒光二抗，37  ℃ 濕盒避光作用 30 min，0． 01 mol·L ^－ 1 PBST避光漂洗 3 次，每次 5  min，甘油緩沖液封片。在顯微鏡上同一視野內(nèi)分別用 488 nm 和 555 nm 波長(zhǎng)進(jìn)行激發(fā)檢測(cè)。熒光顯微鏡下觀察各組海馬區(qū)齒狀回 陽性細(xì)胞數(shù)，每只大鼠隨機(jī)選取海馬齒狀回區(qū)各 3 張切片，每張切片每高倍鏡下計(jì)數(shù) 5 個(gè)視野并拍照， 取其均值作為陽性細(xì)胞數(shù)［9］。

1. 7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用 SPSS 19． 0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料以均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差( x珋± s) 表示，采用析因的方差分析進(jìn)行檢驗(yàn)，組間比較用 LSD 檢驗(yàn)方法， 檢驗(yàn)水準(zhǔn) α = 0． 05。

2 結(jié)果

1 3 組大鼠腦組織齒狀回 Edu 陽性細(xì)胞比較結(jié)果見圖 1 和表 1。單純損傷組和VPA **組大鼠海馬齒狀回內(nèi)Edu 陽性細(xì)胞數(shù)于造模后第3 天開始增高，于造模后第 21 天達(dá)高峰，在同一時(shí)間點(diǎn)單純損傷組和 VPA **組大鼠 Edu 陽性細(xì)胞數(shù)均高于正常對(duì)照組( P ＜ 0． 01) ; 而 VPA **組大鼠各時(shí)間點(diǎn) Edu 陽性細(xì)胞數(shù)較單純損傷組明顯增加( P ＜ 0. 01) 。

2． 2 3 組大鼠腦組織齒狀回 Nestin 陽性細(xì)胞比較結(jié)果見圖 1 和表 1。單純損傷組和VPA **組大 鼠海馬齒狀回內(nèi) Nestin 陽性細(xì)胞數(shù)于造模后第 3 天開始增高，于造模后第 21 天達(dá)高峰，在同一時(shí)間點(diǎn)單純損傷組和 VPA **組 Nestin 陽性細(xì)胞均高于正常對(duì)照組( P ＜ 0． 01) ; 而 VPA **組大鼠各時(shí)間點(diǎn) Nestin 陽性細(xì)胞數(shù)較單純損傷組明顯增加( P ＜ 0. 01) 。

3 討論

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究證明，顱腦損傷后可誘導(dǎo)海馬齒 狀回等部位內(nèi)源性 NSC 的分裂增殖，且多數(shù)可分化為成熟顆粒神經(jīng)元［10-11］。但這種由創(chuàng)傷誘導(dǎo)的神經(jīng)干****往往不能改善腦外傷所造成的損害。VPA 作為組蛋白去乙?；? histon deacetylaseHDAC) 抑制劑，對(duì)**神經(jīng)系統(tǒng)損傷后局部炎癥反應(yīng)有抑制作用 。近年來，有研究表明，無論在體外還是在體內(nèi)，VPA 均具有保護(hù)細(xì)胞和抗細(xì)胞凋亡的作用［12］。

Edu 是一種胸腺嘧啶核苷類似物，能夠在細(xì)胞增殖時(shí)期代替胸腺嘧啶( T) 滲入正在復(fù)制的 DNA 分子中，通過基于 Edu 與 Apollo 熒光染料的特異性反應(yīng)快速檢測(cè)細(xì)胞 DNA 復(fù)制活性，適用于細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、生長(zhǎng)與發(fā)育、DNA 修復(fù)、病毒復(fù)制、細(xì)

胞標(biāo)記示蹤等方面的研究。與傳統(tǒng)的 5-溴脫氧尿嘧啶核苷相比，其分子量小，更容易穿過細(xì)胞膜，能 有效在組織間進(jìn)行滲透，從而實(shí)現(xiàn)快速處理組織和 器官的切片標(biāo)本，而且在檢測(cè)時(shí)不需要對(duì)標(biāo)本進(jìn)行 變性處理，不會(huì)出現(xiàn)因變性引起 DNA 結(jié)構(gòu)改變，因此，有效保證了 DNA 結(jié)構(gòu)的完整性［13-15］，增加了檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確度。Nestin 屬于胚胎性第Ⅵ類中間絲蛋白，主要定位于細(xì)胞基質(zhì)內(nèi)，在**神經(jīng)系統(tǒng) 發(fā)育中僅在胚胎期表達(dá)，出生后即停止表達(dá)［16-17］; 未分化和具有分裂能力的神經(jīng)前體細(xì)胞內(nèi)有豐富的Nestin 陽性表達(dá)，隨著其向神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的進(jìn)一步分化，Nestin 的表達(dá)即逐漸降低，而被星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物即膠質(zhì)纖維酸性蛋白、波形蛋白或 神經(jīng)絲所替代。而顱腦損傷可引起成體腦內(nèi) NSC 增殖，表現(xiàn)為 Nestin 表達(dá)增高，所以多將 Nestin 用于鑒定損傷后**神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi) NSC 的增殖變化［16-17］。因此，本實(shí)驗(yàn)以 Edu 和 Nestin 作為觀察指標(biāo)來研究VPA 對(duì)大鼠顱腦損傷后海馬齒狀回 NSCs 增殖變化的影響。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用 VPA 作用于顱腦損傷大鼠，于不同時(shí)間點(diǎn)觀察 Edu 及 Nestin 陽性細(xì)胞的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，應(yīng)用該**后 Edu 及 Nestin 陽性細(xì)胞數(shù)與正常對(duì)照組及單純損傷組比較明顯增加; VPA **組大鼠 Edu 及 Nestin 陽性細(xì)胞數(shù)在應(yīng)用VPA 3 d 后比單純損傷組稍有增加，之后增加漸趨明顯，至第 21  天達(dá)高峰，28  d 與 21  d 比較不再增加。從而說明 VPA 對(duì)顱腦損傷大鼠海馬成體 NSC 有原位激活作用，在顱腦損傷前 21 d 應(yīng)用該藥對(duì)NSC 的激活作用明顯，之后作用逐漸減弱，這為臨床用藥時(shí)間窗的確定提供了參考依據(jù)。另外，從實(shí)驗(yàn) 中也可以看到，顱腦損傷后不管是單純損傷組還是VPA **組，海馬齒狀回 Edu 及 Nestin 陽性細(xì)胞數(shù)均比正常對(duì)照組大鼠明顯增加，這說明顱腦損傷對(duì) 大鼠海馬成體 NSC 也有原位激活作用，而且 VPA 與顱腦損傷有協(xié)同作用，共同促進(jìn)大鼠海馬成體NSC 原位激活的作用。但 VPA 促進(jìn) NSC 增殖的具體機(jī)制以及其動(dòng)態(tài)遷移的過程尚不清楚，還有待于 進(jìn)一步的系統(tǒng)研究。