PCR引物長(zhǎng)度把控：

一般引物長(zhǎng)度為18~30堿基。總的說(shuō)來(lái)，決定引物退火溫度重要的因素就是引物的長(zhǎng)度。引物的退火溫度一般選擇引物的（Tm值-5℃），有的直接用Tm值。有以下公式可以用于粗略計(jì)算引物的退火溫度。

在引物長(zhǎng)度小于20bp時(shí)：[4(G+C)+2(A+T)]-5℃

在引物長(zhǎng)度大于20bp時(shí)：62.3℃+0.41℃(%G-C)-500/length-5℃

另外有許多軟件也可以對(duì)退火溫度進(jìn)行計(jì)算，其計(jì)算原理會(huì)各有不同，因此有時(shí)計(jì)算出的數(shù)值可能會(huì)有少量差距。為了優(yōu)化PCR反應(yīng)，使用確保退火溫度不低于54℃的短的引物可獲得好的效率和特異性。

總的說(shuō)來(lái)，每增加一個(gè)核苷酸，引物特異性提高4倍，這樣，大多數(shù)應(yīng)用的短引物長(zhǎng)度為18個(gè)核苷酸。引物長(zhǎng)度的上限并不很重要，主要與反應(yīng)效率有關(guān)。由于熵的原因，引物越長(zhǎng)，它退火結(jié)合到靶DNA上形成供DNA聚合酶結(jié)合的穩(wěn)定雙鏈模板的速率越小。

在利用軟件設(shè)計(jì)引物的時(shí)候，可以通過(guò)TM值反過(guò)來(lái)決定引物的長(zhǎng)度，特別是熒光定量PCR的引物，要控制TM=60℃左右。