實(shí)驗(yàn)細(xì)胞常用的染色操作：

1、消化收集細(xì)胞，以2-10×103 cell/coverslip 接種細(xì)胞于24孔板中，滴加細(xì)胞懸液50-100μl，2小時(shí)后補(bǔ)加10%FBS+DMEM500μl

2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)后，顯微鏡下觀察，取細(xì)胞狀態(tài)和細(xì)胞數(shù)量適應(yīng)的玻片做染色。

3、去掉舊培養(yǎng)液，用冰冷的PBS洗兩次，加3.7-4%甲醛0.5ml(in PBS)室溫固定10min

4、PBS洗兩次，加穿膜液0.5ml(0.1%triton X-100+0.1M Gycine)冰上30min

5、PBS洗兩次，加5mg/ml BSA 0.3ml室溫封閉1小時(shí)。

6、PBS洗兩次，取一張封口膜，做好標(biāo)記，加一抗(用5mg/ml BSA稀釋1：50-100)25μl于封口膜上，將蓋玻片細(xì)胞面朝下反扣在一抗液滴上，放在濕盒中室溫孵育1-3小時(shí)，將蓋玻片從封口膜上小心夾起，細(xì)胞面朝上放入原來的24孔板中，PBS洗兩次，取另外一張封口膜，做好標(biāo)記，加二抗(羊抗兔羅丹明，用5mg/ml BSA稀釋1：50-100）25μl于封口膜上，將蓋玻片細(xì)胞面朝下反扣在一{二}抗液滴上，放在濕盒中室溫黑暗中孵育1-3小時(shí)

7、同上PBS洗兩次，同上操作，將玻片與10μl DAPI （1μg/ml in PBS，貯存液：1mg/ml in dd H2O）室溫孵育1-5min.

8、PBS 洗三次，將玻片背面的水分擦干，封片于載玻片上，做好標(biāo)記（時(shí)間，細(xì)胞名稱，實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，號(hào)碼）

9、待封片膠干后可在熒光顯微鏡下觀察，觀察時(shí)注意記錄每張玻片的內(nèi)容以免混淆，觀察完后將玻片放-20℃保存。

10、若只觀察轉(zhuǎn)染了EYFP的熒光蛋白，不需要給內(nèi)源蛋白染色，可直接用DAPI染核后封片。

11、以BSA (5mg/ml)代替一抗，二抗照加為染色的對(duì)照組，做法同上。為了保證實(shí)驗(yàn)有重??性，每次做平行2組以上。