儲存條件:
僅用于科研14℃或-20℃樣品收集、處理及保存方法
1. 血清:使用不含熱原和內(nèi)**的試管,操作過程中避免任何細胞刺激,收集血液后,3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。
2. 血漿:EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000 轉(zhuǎn)離心30 分鐘取上清。
3. 細胞上清液:3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘去除顆粒和聚合物。
4. 組織勻漿:將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘取上清。
5. 保存:如果樣本收集后不及時檢測,請按一次用量分裝,凍存于-20℃,避免反復凍融,在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。
產(chǎn)品名稱
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禽流感病毒H5N1亞型試劑盒熒光PCR法
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規(guī)格
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50T
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貨號
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XG-R63246
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產(chǎn)品特點: 本產(chǎn)品只適用于科研,不能用于臨床診斷
靈敏度高:可檢測個位拷貝數(shù)的基因
特異性高:有效避免非特異性擴增的出現(xiàn)
穩(wěn)定性高:復孔間差異小,實驗結(jié)果重復性強
擴增性能優(yōu):擴增效率高,熒光信號強
PCR實驗方法步驟:
方法
1:在冰浴中,按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer
5 μl dNTP mix (2mM)
4 μl 引物1(10pM)
2 μl 引物2(10pM)
2 μl Taq酶 (2U/μl)
1 μl DNA模板(50ng-1μg/μl)
1 μl 加ddH2O至 50 μl
實驗過程:
一、試劑準備
1. DNA模板
2.對應目的基因的特異引物(在PCR反應中,新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復制,而不能從無到有,憑空合成。這一小段序列就是你所要有設計的引物??梢允荄NA也可以是RNA,一般20多bp,需要根據(jù)你的模板鏈設計。因此,擴增不同的基因需要設計不同的引物)
3.10×PCR Buffer
4.2mM dNTPmix:含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5.Taq酶
二、操作步驟
1.在冰浴中,按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer 5μl
dNTP mixl 4μl
引物1(10pM)
2μl
引物2(10PM)
2μl
Taq酶(2U/μl)
1μl
DNA模板(50ng-1μg/μl) 1 μl
加ddH2O至
50 μl
視PCR儀有無熱蓋,不加或添加石蠟油。
2.調(diào)整好反應程序。將上述混合液稍加離心,立即置PCR儀上,執(zhí)行擴增。一般:在93℃預變性3-5min,進入循環(huán)擴增階段:93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s,循環(huán)30-35次,zui后在72℃ 保溫7min。
3.結(jié)束反應,PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4.PCR的電泳檢測:如在反應管中加有石蠟油,需用100μlLuFang進行抽提反應混合液,以除去石蠟油;否則,直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項
1.PCR反應應該在一個沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進行。zui好設立一個專用的PCR實驗室。
2.純化模板所選用的方法對污染的風險有極大影響。一般而言,只要能夠得到可靠的結(jié)果,純化的方法越簡單越好。
3.所有試劑都應該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應戴手套。
4.PCR試劑配制應使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水,采用0.22μm濾膜過濾高壓。
5.試劑都應該以大體積配制,試驗一下是否滿意,然后分裝成僅夠一次使用的量儲存,從而確保實驗與實驗之間的連續(xù)性。
6.試劑或樣品準備過程中都要使用一次性的塑料瓶和管子,玻璃器皿應洗滌干凈并高壓。
7.PCR的樣品應在冰浴上化開,并且要充分混勻。
檢測步驟:
一、 試劑的準備
從試劑盒中取出熒光PCR反應液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX),冰上融化并振蕩混勻后,10000rpm離心10s。
設所需要的PCR反應管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照),每個測試反應體系配制如下表:
試劑 每個反應加入的量 N個反應加入的量
熒光PCR反應液 14μL N×14μL
酶混合物 1 μL N×1 μL
總量 15 μL N×15μL
(1) 計算好各試劑的使用量,加入一適當體積潔凈離心管中,充分混勻,10000rpm離心10s,向設定的N個PCR反應管中分別加入15μL熒光PCR反應液,向每管中加入處理后樣品或陰性對照(NTC)和陽性對照(BC-PTC)5μL,10000rpm瞬時離心10秒。
7.2 qPCR反應條件
將各反應管放入定量PCR儀器的反應槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時收集熒光信號。報告基團:設置為FAM。淬滅基團:NONE,請勿選擇ROX參比熒光。
小鼠小腸粘膜上皮細胞完全培養(yǎng)基 100mL異牡荊素(標準品)質(zhì)量規(guī)格:HPLC≥98%,標準品Isovitexin
EC9706人食管癌細胞 Human esophageal cancer
cell line EC9706. DMEM+10%FBS異歐前胡素(標準品)質(zhì)量規(guī)格:HPLC≥98%,標準品Isoimperatorin
IL6 Protein Human 重組人 IL6 / Ierleukin-6 蛋白異嗪皮啶(標準品)質(zhì)量規(guī)格:HPLC≥98%,標準品Isofraxidin
SF763(人腦瘤細胞) 5×106cells/瓶×2 J82(膀胱癌細胞)異去氫鉤藤堿(標準品)質(zhì)量規(guī)格:HPLC≥98%,標準品Isocorynoxeine
CL-0060CHL(倉鼠肺細胞)5×106cells/瓶×2異羅漢果皂苷 V質(zhì)量規(guī)格:HPLC≥98%,標準品isomogroside V
B3G2 Others Human 人 B3G2 人細胞裂解液 (陽性對照) 朝藿定A(標準品)Epimedin A質(zhì)量規(guī)格:HPLC≥98%,標準品
人髂動脈內(nèi)皮細胞完全培養(yǎng)基 100mL朝藿定A1(標準品)Epimedin A1質(zhì)量規(guī)格:HPLC≥98%,標準品
L929細胞,小鼠成纖維細胞 3T3-L1(小鼠脂肪細胞) 小鼠腦瘤細胞;BC3H1朝藿定B(標準品)Epimedin B質(zhì)量規(guī)格:HPLC≥98%,標準品
CSF1 Protein Human 重組人 / 食蟹猴 M-CSF / CSF-1 蛋白 (His 標簽)朝藿定C(標準品)Epmedin C質(zhì)量規(guī)格:HPLC≥98%,標準品
TF-1(人血液白血病細胞) 5×106cells/瓶×2 小鼠腦瘤細胞;BC3H1橙黃決明素(標準品)Aurantio-obtusin質(zhì)量規(guī)格:HPLC≥98%,標準品
CL-0352HFF-1(人成纖維細胞)5×106cells/瓶×2多聚嶙酸鈉500毫克
MEF, 小鼠胚胎成纖維細胞偶氮二異務晴 2,2'-czodi(2-mqthylbutyronitnilq)1347-08-7
人胚肺二倍體細胞;HEL-2 人胎盤羊膜細胞完全培養(yǎng)基 100mL十九烷5克
人氣管平滑肌細胞RNAHTSMC miRNA5 μg本酸脫羧酶培養(yǎng)基10克RT
CAMK1G Others Human 人 CAMK1G / CLICK III / CaMKIgamma 桿狀病毒-昆蟲細胞裂解液 (陽性對照) 2420-87-33,3’4,4’-聯(lián)本四羧酸二酐3,3',4,4'-Bipxenyltetracarboxylic
dianhydride
NCI-H2170(人肺鱗癌細胞) 5×106cells/瓶×2Gly-lleu甘酰-L-異亮酸1克BR,98%
BRL(大鼠肝細胞) 5×106cells/瓶×2 CM-M054小鼠成纖維細胞完全培養(yǎng)基100mL 人結(jié)直腸腺癌細胞;Caco-23,4-二禽流感病毒H5N1亞型試劑盒熒光PCR法安基本加醋;3,4-二安基安息香醋 3,4-DicMinobqnzoic ccid619-02-6
恒河猴皮膚細胞;RM-S1Fmoc-D-Cys(Trt)-OHN-Fmoc-N'-三本甲基- D-半胱酸25克特,98%
NCF2 Others Human 人 NCF2 / NCF-2 / P67phox 桿狀病毒-昆蟲細胞裂解液 (陽性對照) 快速1試驗瓊脂shēng huà shì jì容量:2~8℃100毫升
胰腺星狀細胞Many types of cells包裝:5 × 105方(1ml)胞苷-5’-二1酸鈉鹽NA
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