PCR實(shí)驗(yàn)方法步驟：
方法
1：在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。     
10×PCR buffer                   
5 μl     dNTP mix （2mM）             
4 μl     引物1（10pM）                 
2 μl     引物2（10pM）                 
2 μl     Taq酶 （2U/μl）               
1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  
1 μl      加ddH2O至 50 μl  

產(chǎn)品特點(diǎn): 本產(chǎn)品只適用于科研，不能用于臨床診斷
靈敏度高：可檢測(cè)個(gè)位拷貝數(shù)的基因
特異性高：有效避免非特異性擴(kuò)增的出現(xiàn)
穩(wěn)定性高：復(fù)孔間差異小，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性強(qiáng)
擴(kuò)增性能優(yōu)：擴(kuò)增效率高，熒光信號(hào)強(qiáng)

儲(chǔ)存條件：
僅用于科研14℃或－20℃樣品收集、處理及保存方法
1. 血清：使用不含熱原和內(nèi)**的試管，操作過程中避免任何細(xì)胞刺激，收集血液后，3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。
2. 血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000 轉(zhuǎn)離心30 分鐘取上清。
3. 細(xì)胞上清液：3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘去除顆粒和聚合物。
4. 組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘取上清。
5. 保存：如果樣本收集后不及時(shí)檢測(cè)，請(qǐng)按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復(fù)凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

檢測(cè)步驟：
一、 試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對(duì)照+1管陽(yáng)性對(duì)照)，每個(gè)測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個(gè)反應(yīng)加入的量 N個(gè)反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14μL N×14μL
酶混合物 1 μL N×1 μL
總量 15 μL N×15μL
（1） 計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對(duì)照(NTC)和陽(yáng)性對(duì)照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時(shí)離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴(kuò)增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時(shí)收集熒光信號(hào)。報(bào)告基團(tuán)：設(shè)置為FAM。淬滅基團(tuán)：NONE，請(qǐng)勿選擇ROX參比熒光。

小鼠腮腺細(xì)胞完全培養(yǎng)基 100mLL-谷氨酸5乙酯質(zhì)量規(guī)格：0.985H-Glu(OEt)-OH

HUVEC[HUV-EC-C]人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 Human umbilical vein endothelial cells HUVEC[HUV-EC-C] DMEM+10%FBSN-乙酰-DL-亮氨酸質(zhì)量規(guī)格：0.98N-Acetyl-DL-leucine

IL18BP Protein Mouse 重組小鼠 IL18BP 蛋白 (His 標(biāo)簽)N-碳芐氧基賴氨酸,N6-Cbz-L-賴氨酸質(zhì)量規(guī)格：98%，BRN6-Cbz-L-Lysine

PA-1(人卵巢腺癌細(xì)胞) 5×106cells/瓶×2 H9c2(2-1)(大鼠心肌細(xì)胞)DL-賴氨酸質(zhì)量規(guī)格：>98%,BRDL-Lysine

CL-0269CW-2(人結(jié)腸癌細(xì)胞)5×106cells/瓶×2DL-精氨酸鹽酸鹽質(zhì)量規(guī)格：>98%,BRDL-Arginine
CRT(人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞) 5×106cells/瓶×2 腸靜脈內(nèi)皮細(xì)胞Many types of cells包裝：5 × 105方(1ml)草酸亞錫(>98%,BR)Tin (II) oxalate質(zhì)量規(guī)格：>98%,BR

人脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞HA-sp二氧化錫(> 99%,BR)Tin (IV) oxide質(zhì)量規(guī)格：> 99%,BR

IL2RA Others Cynomolgus 食蟹猴 IL2RA 人細(xì)胞裂解液 (陽(yáng)性對(duì)照) 硫酸亞鈦(>98%,BR)Titanium (III) sulfate質(zhì)量規(guī)格：>98%,BR

犬腎細(xì)胞;MDCK(NBL-2)硫酸鈦(>96%,BR)Titanium (IV) sulfate質(zhì)量規(guī)格：>96%,BR

801-D細(xì)胞，人巨細(xì)胞性肺癌細(xì)胞 轉(zhuǎn)入Tet-off調(diào)控，含EGFP基因的CHO細(xì)胞,CHO-AA8細(xì)胞 CM-M026小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞完全培養(yǎng)基100mL檸檬酸三丁酯(>98%,BR)Tributyl 質(zhì)量規(guī)格：>98%,BR
NCI-H1395人肺腺癌細(xì)胞 Human lung adenocarcinoma cell line NCI-H1395 RPMI-1640(GIBCO)+10%FBS[Tyr9]- β-促 (豬)質(zhì)量規(guī)格：>95%,BR[Tyr9]- β-MSH (porcine)

FAM3D Protein Human 重組人 FAM3D 蛋白 (His 標(biāo)簽)α-心鈉素(1-28), human質(zhì)量規(guī)格：>95%,BRα-ANF(1-28), human

293來源病毒包裝細(xì)胞;ΦA 人上皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基 100mLα-促質(zhì)量規(guī)格：>95%,BRα-MSH

人髓核細(xì)胞總RNAHNPC NAβ-淀粉樣蛋白(1-42),人質(zhì)量規(guī)格：>95%,BRβ-Amyloid Peptide (1-42), human

REG1A Others Cynomolgus 食蟹猴 REG1A / PSPS 人細(xì)胞裂解液 (陽(yáng)性對(duì)照) [Nle8’18,Tyr34]-甲狀旁腺(7-34)酰胺 (牛)質(zhì)量規(guī)格：>95%,BR[Nle8’18,Tyr34]-pTH (7-34) amide (bovine)
CL-0252A2(人腺樣囊性癌細(xì)胞)5×106cells/瓶×2本扎錄，英文名或英文縮寫：HDBAC，級(jí)別：IND，規(guī)格：25克

人低分化肺腺癌細(xì)胞;SK-LU-1 大鼠腦靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基 100mL雌摸司汀鱗醋內(nèi) (17-bqtc)-qstrc-1,3,5(10)-triqnq-3,17-diol 3-(bis(2-chloroqthyl)ccrbcmctq) 17-(dixy7nogqnphosphctq) diwo7ium sclt 202-73-9

MMQ 小鼠垂體瘤細(xì)胞申醋 LqcD(II) cRSqNcTq 3687-31-8

TIMP2 Others Human 人 TIMP2 / TIMP-2 人細(xì)胞裂解液 (陽(yáng)性對(duì)照) 4-甲基-1H-咪唑，英文名或英文縮寫：4-metxylimidazole，級(jí)別：LR，規(guī)格：500克

色素細(xì)胞生長(zhǎng)添加物(不含TPA)MelGS-22304-96-3N-芐氧羰基-L-天冬堿N-Benzyloxycarbonyl-L-asparagine
實(shí)驗(yàn)過程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長(zhǎng)期保存。
4．PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測(cè)。
綠膿桿菌試劑盒熒光PCR法三、注意事項(xiàng)
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。zui好設(shè)立一個(gè)專用的PCR實(shí)驗(yàn)室。
２．純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾高壓。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量?jī)?chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。

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