PCR實(shí)驗(yàn)方法步驟：
方法
1：在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o(wú)菌0.5ml離心管中。     
10×PCR buffer                   
5 μl     dNTP mix （2mM）             
4 μl     引物1（10pM）                 
2 μl     引物2（10pM）                 
2 μl     Taq酶 （2U/μl）               
1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  
1 μl      加ddH2O至 50 μl  

產(chǎn)品特點(diǎn): 本產(chǎn)品只適用于科研，不能用于臨床診斷
靈敏度高：可檢測(cè)個(gè)位拷貝數(shù)的基因
特異性高：有效避免非特異性擴(kuò)增的出現(xiàn)
穩(wěn)定性高：復(fù)孔間差異小，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性強(qiáng)
擴(kuò)增性能優(yōu)：擴(kuò)增效率高，熒光信號(hào)強(qiáng)

儲(chǔ)存條件：
僅用于科研14℃或－20℃樣品收集、處理及保存方法
1. 血清：使用不含熱原和內(nèi)**的試管，操作過(guò)程中避免任何細(xì)胞刺激，收集血液后，3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。
2. 血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000 轉(zhuǎn)離心30 分鐘取上清。
3. 細(xì)胞上清液：3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘去除顆粒和聚合物。
4. 組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘取上清。
5. 保存：如果樣本收集后不及時(shí)檢測(cè)，請(qǐng)按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復(fù)凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

檢測(cè)步驟：
一、 試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對(duì)照+1管陽(yáng)性對(duì)照)，每個(gè)測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個(gè)反應(yīng)加入的量 N個(gè)反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14μL N×14μL
酶混合物 1 μL N×1 μL
總量 15 μL N×15μL
（1） 計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對(duì)照(NTC)和陽(yáng)性對(duì)照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時(shí)離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴(kuò)增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時(shí)收集熒光信號(hào)。報(bào)告基團(tuán)：設(shè)置為FAM。淬滅基團(tuán)：NONE，請(qǐng)勿選擇ROX參比熒光。

小鼠腦瘤細(xì)胞;BC3H1麥芽糖（標(biāo)準(zhǔn)品）質(zhì)量規(guī)格：HPLC>98%,標(biāo)準(zhǔn)品D-(+)-Maltose monohydrate

CHL1 Others Mouse 小鼠 CHL-1 人細(xì)胞裂解液 (陽(yáng)性對(duì)照) 尿素（標(biāo)準(zhǔn)品）質(zhì)量規(guī)格：含量測(cè)定Urea

CM-R106大鼠神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞完全培養(yǎng)基100mL生物素（標(biāo)準(zhǔn)品）質(zhì)量規(guī)格：HPLC法含量測(cè)定D-Biotin

KYSR450細(xì)胞，人食管癌細(xì)胞 人XG惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞,SF-295細(xì)胞 豬靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞;ZYM-SVEC01特非那定（標(biāo)準(zhǔn)品）質(zhì)量規(guī)格：含量測(cè)定Terfenadine

CHL(倉(cāng)鼠肺細(xì)胞) 5×106cells/瓶×2素(含檸檬酸鹽緩沖液)質(zhì)量規(guī)格：>98%,進(jìn)分Tetrodotoxin
EREG Others Mouse 小鼠 EREG / epiregulin 人細(xì)胞裂解液 (陽(yáng)性對(duì)照) 丙谷二肽,L-丙-谷二肽,力肽Ala-Gln 質(zhì)量規(guī)格：>98%,BR

MDA-MB-231 人癌細(xì)胞L-精氨酸甲酯二鹽酸H-Arg-OMe·2HCl質(zhì)量規(guī)格：>99%,BR

CL-0369IR983F(大鼠骨髓瘤細(xì)胞)5×106cells/瓶×2D-丙氨酰胺鹽酸鹽D-Alaninamide 質(zhì)量規(guī)格：>98%,BR

CSC, 小鼠心肌細(xì)胞硝酸芬替康唑; 硝酸芬康唑Fenticonazole Nitrate質(zhì)量規(guī)格：>99%,BR

人胚肺二倍體細(xì)胞;HEL-1 人胃粘膜上皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基 100mL1-芐基D-谷氨酸1-Benzyl D-Glutamate質(zhì)量規(guī)格：0.98
CL-0463UM-UC-3(人膀胱移行細(xì)胞癌)5×106cells/瓶×2俾氏麥棕Y250毫克保存：-20℃

人腎癌細(xì)胞;A498 大鼠心肌成纖維細(xì)胞完全培養(yǎng)基 100mL2-羌基-5-氧基本加醋 5-Mqthoxysclicylic ccid 61--4

raw264.7 小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞BES,wo7iumSALTBES 鈉100G66992-27-6RT

PLA2G1B Others Mouse 小鼠 Phospholipase-A2 / PLA2G1B 人細(xì)胞裂解液 (陽(yáng)性對(duì)照) 葡聚糖凝膠S-300HR7.5KU保存：-20℃

人導(dǎo)管瘤細(xì)胞;UACC812(腐胺)
IFNA2 Protein Cynomolgus 重組食蟹猴 IFNA2 / Ierferon alpha 2 蛋白 (His 標(biāo)簽)Ferric枸椽酸鐵25毫克生物技術(shù)級(jí)，90%

Hs68(人男性正常細(xì)胞) 5×106cells/瓶×2 變異鏈球菌肌酐;肌臘酐;肌安基酐;縮水肌肉速 Crqctininq;Mqthylhydcntoin-2-iMidq;2-IMino-1-Mqthyl-4-iMidczolidinonq;2-IMino-N-Mqthylhydcntoin1960/7/2

冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞Many types of cells包裝：5 × 105方(1ml)BOC-L-本酸shēng huà shì jì容量：RT10克

TLR3 Others Mouse 小鼠 TLR3 / CD283 桿狀病毒-昆蟲(chóng)細(xì)胞裂解液 (陽(yáng)性對(duì)照) TRICInepUFFERTRICINE BUFFER超級(jí)

人前列腺癌低轉(zhuǎn)移細(xì)胞株;PC-3M-2B42,6-Dichloropxenolindopxenol, 1g/5g/25g原裝 FLUKA 36180
實(shí)驗(yàn)過(guò)程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無(wú)到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o(wú)菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無(wú)熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長(zhǎng)期保存。
4．PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測(cè)。
腸道病毒68型試劑盒熒光PCR法三、注意事項(xiàng)
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒(méi)有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。zui好設(shè)立一個(gè)專用的PCR實(shí)驗(yàn)室。
２．純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒(méi)有核酸和核酸酶的污染。操作過(guò)程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過(guò)濾高壓。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量?jī)?chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準(zhǔn)備過(guò)程中都要使用一次性的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開(kāi)，并且要充分混勻。

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