PCR實(shí)驗(yàn)方法步驟：
方法
1：在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。     
10×PCR buffer                   
5 μl     dNTP mix （2mM）             
4 μl     引物1（10pM）                 
2 μl     引物2（10pM）                 
2 μl     Taq酶 （2U/μl）               
1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  
1 μl      加ddH2O至 50 μl  

產(chǎn)品特點(diǎn): 本產(chǎn)品只適用于科研，不能用于臨床診斷
靈敏度高：可檢測個位拷貝數(shù)的基因
特異性高：有效避免非特異性擴(kuò)增的出現(xiàn)
穩(wěn)定性高：復(fù)孔間差異小，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性強(qiáng)
擴(kuò)增性能優(yōu)：擴(kuò)增效率高，熒光信號強(qiáng)

儲存條件：
僅用于科研14℃或－20℃樣品收集、處理及保存方法
1. 血清：使用不含熱原和內(nèi)**的試管，操作過程中避免任何細(xì)胞刺激，收集血液后，3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。
2. 血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000 轉(zhuǎn)離心30 分鐘取上清。
3. 細(xì)胞上清液：3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘去除顆粒和聚合物。
4. 組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘取上清。
5. 保存：如果樣本收集后不及時檢測，請按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復(fù)凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

檢測步驟：
一、 試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照)，每個測試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個反應(yīng)加入的量 N個反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14μL N×14μL
酶混合物 1 μL N×1 μL
總量 15 μL N×15μL
（1） 計算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對照(NTC)和陽性對照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴(kuò)增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時收集熒光信號。報告基團(tuán)：設(shè)置為FAM。淬滅基團(tuán)：NONE，請勿選擇ROX參比熒光。

非洲綠猴腎細(xì)胞系/HCV-E2;Vero-HCV-E2N-(1,3,4-Thiadiazolyl)煙酰胺質(zhì)量規(guī)格：美國進(jìn)口N-(1,3,4-Thiadiazolyl)nicotinamide

FN1 Others Human 人 Fibronectin / Fibronectin Fragme 2 人細(xì)胞裂解液 (陽性對照) β-煙酰胺單核苷酸質(zhì)量規(guī)格：美國進(jìn)口β-Nicotinamide mononucleotide

615小鼠T細(xì)胞性白血病瘤株;L7712環(huán)丙孕酮質(zhì)量規(guī)格：美國進(jìn)口Cyproterone

MAP2K6 Others Human 人 MKK6 / MEK6 / MAP2K6 (207 Ser/Asp, 211 Thr/Asp) 桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞裂解液 (陽性對照) 15β-羥基醋酸環(huán)丙孕酮質(zhì)量規(guī)格：美國進(jìn)口15β-Hydroxy Cyproterone Acetate

CM-M017小鼠胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基100mL咽側(cè)體抑制素Ⅳ質(zhì)量規(guī)格：>95%,BRAllatostatin IV
FIGF Protein Human 重組人 VEGF-D / VEGFD / FIGF 蛋白 (His 標(biāo)簽)DL-半胱氨酸DL-Cysteine 質(zhì)量規(guī)格：>97%,易氧化

小鼠神經(jīng)質(zhì)細(xì)胞(MN-sn)(1×106) T24, 人膀胱癌細(xì)胞 HumanL-谷氨酰胺叔丁酯鹽酸鹽L-Glutamine t-butyl ester 質(zhì)量規(guī)格：0.98

犬腎細(xì)胞;MDCK(NBL-2)L-谷氨酸-5-叔丁酯-1-甲酯鹽酸鹽L-Glutamic acid 5-tert-butyl 1-methyl ester  質(zhì)量規(guī)格：>95%,BR

GAD2 Others Mouse 小鼠 GAD65 / GAD2 桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞裂解液 (陽性對照) N-芐基甘氨酸鹽酸鹽Bzl-Gly-OH·HCl質(zhì)量規(guī)格：0.98

皮膚肥大細(xì)胞Many types of cells包裝：5 × 105方(1ml)甘氨酸芐酯鹽酸鹽Glycine benzyl ester 質(zhì)量規(guī)格：0.98
人胚腎細(xì)胞(亞系克隆);FIP293D-谷酰胺10克RT

ADAM9 Others Mouse 小鼠 ADAM9 人細(xì)胞裂解液 (陽性對照) 二十二醇 Behenyl Alcohol,98% 661-19-8 25G 通用試劑

HCC827 人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞拂化 litxium fluoridq7789/4/4

2V6.11人胚腎細(xì)胞 Human embryonic kidney cell line 2V6.11 MEM培養(yǎng)基(GIBCO)+10%FBS輔酶A10克RT

TNF Protein Ferret 重組雪貂 TNF-alpha / TNFA 蛋白PH緩沖液 PH5.0(20℃)NA
HA Others H2N2 甲型流感 H2N2 (A/Guiyang/1/1957) 血凝素HA1 (Hemagglutinin) 人細(xì)胞裂解液 (陽性對照) ZincAcetateDihydrate醋酸鋅二水美國藥典級白色精細(xì)粉末RTsigma

人EB病毒轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞;CGM1暈苯 Coronene,97% 191-07-1 100MG 通用試劑

正常大鼠腎細(xì)胞;NRK 結(jié)腸腺癌細(xì)胞，COLO-320細(xì)胞 ST細(xì)胞，豬細(xì)胞系(ST)務(wù)二臘酐 Glutcric cnhydridq 108-22-4

Ca Ski, 人細(xì)胞 HumanDigitonin洋地黃皂苷5克BR，95%

HAVCR1 Others Cynomolgus 食蟹猴 HAVCR1 / TIM1 / TIMD1 人細(xì)胞裂解液 (陽性對照) 佛手油NA
實(shí)驗(yàn)過程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。zui好設(shè)立一個專用的PCR實(shí)驗(yàn)室。
２．純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險有大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。
柯薩奇病毒B5型試劑盒熒光PCR法３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾高壓。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。

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