PCR實驗方法步驟：
方法
1：在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。     
10×PCR buffer                   
5 μl     dNTP mix （2mM）             
4 μl     引物1（10pM）                 
2 μl     引物2（10pM）                 
2 μl     Taq酶 （2U/μl）               
1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  
1 μl      加ddH2O至 50 μl  

產(chǎn)品特點: 本產(chǎn)品只適用于科研，不能用于臨床診斷
靈敏度高：可檢測個位拷貝數(shù)的基因
特異性高：有效避免非特異性擴增的出現(xiàn)
穩(wěn)定性高：復(fù)孔間差異小，實驗結(jié)果重復(fù)性強
擴增性能優(yōu)：擴增效率高，熒光信號強

儲存條件：
僅用于科研14℃或－20℃樣品收集、處理及保存方法
1. 血清：使用不含熱原和內(nèi)**的試管，操作過程中避免任何細胞刺激，收集血液后，3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。
2. 血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000 轉(zhuǎn)離心30 分鐘取上清。
3. 細胞上清液：3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘去除顆粒和聚合物。
4. 組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘取上清。
5. 保存：如果樣本收集后不及時檢測，請按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復(fù)凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

檢測步驟：
一、 試劑的準備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照)，每個測試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個反應(yīng)加入的量 N個反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14μL N×14μL
酶混合物 1 μL N×1 μL
總量 15 μL N×15μL
（1） 計算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對照(NTC)和陽性對照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時收集熒光信號。報告基團：設(shè)置為FAM。淬滅基團：NONE，請勿選擇ROX參比熒光。

U-373MG-EGFP(Ubc-EGFP慢病毒構(gòu)建穩(wěn)定株)人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞 U-373MG-EGFP (Ubc-EGFP leiviral consuct stable sain) of human brain glioma cells DMEM+10% FBS尼群地平(標(biāo)準品)質(zhì)量規(guī)格：含量測定Nitrendipine

IL2 Protein Mouse 重組小鼠 Ierleukin-2 / IL-2 蛋白華蟾毒它靈;華蟾素(標(biāo)準品)質(zhì)量規(guī)格：HPLC≥98%，標(biāo)準品Cinobufotalin

人成纖維母細胞-新生兒(HDF-n)( 5×105 ) MA, 小鼠星形膠質(zhì)細胞 Mouse維甲酰酚胺質(zhì)量規(guī)格：>98%,BRFenretinide(4-HPR)

鼬肺上皮細胞;MV-1-Lu2-氨基嘌呤,異腺嘌呤;異腺素;2-AP質(zhì)量規(guī)格：>98%,BR2-Aminopurine

MFGE8 Others Human 人 MFG-E8 / lactadherin / MFGE8 桿狀病毒-昆蟲細胞裂解液 (陽性對照) 尼羅替尼-d3質(zhì)量規(guī)格：美國進口Nilotinib-d3
HA Others H5N1 甲型流感 H5N1 (A/VietNam/1203/2004) 血凝素 (Hemagglutinin / HA) 人細胞裂解液 (陽性對照) L-谷氨酸鈉，一水L-Glutamic acid mono salt hydrate質(zhì)量規(guī)格：>99%

牛腎細胞;MDBK(BVDV-free)DL-苦杏仁酸DL-Mandelic acid質(zhì)量規(guī)格：AR

CD70 Others Rat 大鼠 CD70 / CD27L / TNFSF7 人細胞裂解液 (陽性對照) 抗壞血酸；維生素CAscorbic acid；vitamin C質(zhì)量規(guī)格：AR;>99%

人肺成纖維細胞完全培養(yǎng)基 100mL維生素C(標(biāo)準品)Ascorbic acid；vitamin C質(zhì)量規(guī)格：含量測定

OCM-1細胞，人眼脈絡(luò)色素瘤細胞 繩狀青霉 小鼠T細胞瘤細胞;Cyc-Tag(S49)十八胺; 十八烷基胺; 硬脂胺Octadecanamine質(zhì)量規(guī)格：AR
CD226 Others Human 人 CD226 / DNAM-1 人細胞裂解液 (陽性對照) GUANIDINExy7noCHLORIDE鹽酸胍蛋白組學(xué)級100G1950-1-1RT

人脊髓星形膠質(zhì)細胞裂解物HA-sp L本加醋銨;安息香醋銨 cMMoniuM bqnzoctq 1863-63-4

CD55 Others Rat 大鼠 CD55 / DAF 人細胞裂解液 (陽性對照) 二丁基安 Dibutylcminq 111-9-

人小腦顆粒細胞完全培養(yǎng)基 100mL甲基紅鈉1公斤

NRK細胞，大鼠腎小管上皮細胞 PT-67(病毒轉(zhuǎn)染小鼠細胞) 豬腎細胞;PK(15)(腦心浸液瓊脂)
U-2 OS人骨肉瘤細胞 U-2 human osteosarcoma cell line OS McCoy's 5A+10%FBS大扶康，英文名或英文縮寫：Fluconazole，級別：BR，規(guī)格：5KU

Ealy926細胞，人腸系膜下腔動脈血管內(nèi)皮細胞 白色假絲酵母/白色念球菌 人肺動脈內(nèi)皮細胞總RNAHPAEC NA色甘醋內(nèi) CroMolyn wo7ium 1286-37-6

RBL-1(大鼠嗜堿性粒細胞性白血病細胞) 5×106cells/瓶×2wo7iumxy7noXIDEPELLETSACS級小球RT不sigma

F81(貓腎細胞) 5×106cells/瓶×2 CL-0281HELF(人胚肺成纖維細胞)5×106cells/瓶×2 犬腎細胞;MDCK(NBL-2)5′-CTP，2Na5-胞嘧啶核苷三嶙酸二鈉鹽5克BR，90%

癌組織源性原代細胞Many types of cells包裝：5 × 105方(1ml)/1ml(2-脫氧-D-核糖)
實驗過程：
一、試劑準備
1. DNA模板
2．對應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計。因此，擴增不同的基因需要設(shè)計不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進入循環(huán)擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
輪狀病毒B組試劑盒熒光PCR法三、注意事項
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進行。zui好設(shè)立一個專用的PCR實驗室。
２．純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險有大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾高壓。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲存，從而確保實驗與實驗之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準備過程中都要使用一次性的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。

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