產(chǎn)品特點(diǎn): 本產(chǎn)品只適用于科研,不能用于臨床診斷
靈敏度高:可檢測個位拷貝數(shù)的基因
特異性高:有效避免非特異性擴(kuò)增的出現(xiàn)
穩(wěn)定性高:復(fù)孔間差異小,實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性強(qiáng)
擴(kuò)增性能優(yōu):擴(kuò)增效率高,熒光信號強(qiáng)
產(chǎn)品名稱
|
諾如病毒GⅡ型試劑盒熒光PCR法
|
規(guī)格
|
50T
|
貨號
|
XG-R63411
|
儲存條件:
僅用于科研14℃或-20℃樣品收集、處理及保存方法
1. 血清:使用不含熱原和內(nèi)**的試管,操作過程中避免任何細(xì)胞刺激,收集血液后,3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。
2. 血漿:EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000 轉(zhuǎn)離心30 分鐘取上清。
3. 細(xì)胞上清液:3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘去除顆粒和聚合物。
4. 組織勻漿:將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘取上清。
5. 保存:如果樣本收集后不及時檢測,請按一次用量分裝,凍存于-20℃,避免反復(fù)凍融,在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。
PCR實(shí)驗(yàn)方法步驟:
方法
1:在冰浴中,按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer
5 μl dNTP mix (2mM)
4 μl 引物1(10pM)
2 μl 引物2(10pM)
2 μl Taq酶 (2U/μl)
1 μl DNA模板(50ng-1μg/μl)
1 μl 加ddH2O至 50 μl
實(shí)驗(yàn)過程:
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2.對應(yīng)目的基因的特異引物(在PCR反應(yīng)中,新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制,而不能從無到有,憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物??梢允荄NA也可以是RNA,一般20多bp,需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此,擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物)
3.10×PCR Buffer
4.2mM dNTPmix:含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5.Taq酶
二、操作步驟
1.在冰浴中,按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer 5μl
dNTP mixl 4μl
引物1(10pM)
2μl
引物2(10PM)
2μl
Taq酶(2U/μl)
1μl
DNA模板(50ng-1μg/μl) 1 μl
加ddH2O至
50 μl
視PCR儀有無熱蓋,不加或添加石蠟油。
2.調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心,立即置PCR儀上,執(zhí)行擴(kuò)增。一般:在93℃預(yù)變性3-5min,進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段:93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s,循環(huán)30-35次,zui后在72℃ 保溫7min。
3.結(jié)束反應(yīng),PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4.PCR的電泳檢測:如在反應(yīng)管中加有石蠟油,需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液,以除去石蠟油;否則,直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項(xiàng)
1.PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。zui好設(shè)立一個專用的PCR實(shí)驗(yàn)室。
2.純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險(xiǎn)有大影響。一般而言,只要能夠得到可靠的結(jié)果,純化的方法越簡單越好。
3.所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。
4.PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水,采用0.22μm濾膜過濾高壓。
5.試劑都應(yīng)該以大體積配制,試驗(yàn)一下是否滿意,然后分裝成僅夠一次使用的量儲存,從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。
6.試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性的塑料瓶和管子,玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓。
7.PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開,并且要充分混勻。
小鼠周神經(jīng)成纖維細(xì)胞(MPNF)(5×105) HL-60, 人早幼粒白血病細(xì)胞 Human氧化偶氮苯-4,4'-二羧酸二乙酯(>97.0%(GC))質(zhì)量規(guī)格:>97.0%(GC)Diethyl
Azoxybenzene-4,4'-dicarboxylate
中國倉鼠肺細(xì)胞;CHL4,4'-雙(己氧基)氧化偶氮苯(>96.0%(N))質(zhì)量規(guī)格:>96.0%(N)4,4'-Bis(hexyloxy)azoxybenzene
人髓核細(xì)胞(HNPC)(5×105)4,4'-二戊氧基氧化偶氮苯(>95.0%(N))質(zhì)量規(guī)格:>95.0%(N)4,4'-Diamyloxyazoxybenzene
CL-0083FaDu(人咽鱗癌細(xì)胞)5×106cells/瓶×24,4'-二丁氧基氧化偶氮苯質(zhì)量規(guī)格:4,4'-Dibutoxyazoxybenzene
小鼠垂體瘤細(xì)胞;GT1-1 大鼠角膜成纖維細(xì)胞完全培養(yǎng)基 100mL水楊酸(標(biāo)準(zhǔn)品)質(zhì)量規(guī)格:含量測定Salicylic acid
Hep 3B(人肝癌細(xì)胞) 5×106cells/瓶×2垂體腺苷酸環(huán)化酶激活肽-27,人,小鼠,綿羊,豬,大鼠PACAP-27 (human,
mouse,ovine, porcine, rat)質(zhì)量規(guī)格:>95%,BR
AGRP Others Human 人 AgRP 人細(xì)胞裂解液 (陽性對照) 垂體腺苷酸環(huán)化酶激活肽-27(6-27),人,雞,小鼠,豬,大鼠PACAP-27 (6-27)
(human,chicken, mouse, ovine,porcine, rat)質(zhì)量規(guī)格:>95%,BR
人角膜上皮細(xì)胞HCEpiC垂體腺苷酸環(huán)化酶激活肽-38(16-38),人,雞,小鼠,綿羊,豬,大鼠PACAP-38 (16-38)
(human,chicken, mouse, ovine,porcine, rat)質(zhì)量規(guī)格:>95%,BR
SECTM1 Others Human 人 SECTM1 / K12 人細(xì)胞裂解液 (陽性對照) 垂體腺苷酸環(huán)化酶激活肽相關(guān)肽(1-29),大鼠PACAP-Related
Peptide (1-29)(rat)質(zhì)量規(guī)格:>95%,BR
HMy2.CIR 人 B 母細(xì)胞胰多肽,人Pancreatic Polypeptide,human質(zhì)量規(guī)格:>95%,BR
CD93 Others Human 人 CD93 / C1QR1 人細(xì)胞裂解液 (陽性對照) PEPSTATIN胃蛋白酶抑制劑超級白色粉末COLDsigma
MS751 人頸表皮癌細(xì)胞3-羌基炳晴puriss》99.0% 3-xy7noxypropionitnilq 109-78-4
NCI-H661人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞 NCI-H661 large cell lung
cancer cell RPMI-1640(GIBCO)+10%FBSpxenOLPHTHALEIN酚酞白色至米白色固體RTsigma
AIMP1 Protein Human 重組人 AIMP1 / EMAP2 / SCYE1 蛋白 (His 標(biāo)簽)PROTEINMWMARKER,HIGHRANGE蛋白Marker生物技術(shù)級液體FROZENsigma
人胚肺二倍體細(xì)胞;2BS 人前列腺成纖維細(xì)胞完全培養(yǎng)基 100mL9004-34-6微晶纖維素Microcrystalline
Cellulose (AS)
LTBR Others Rat 大鼠 LTBR / TNFRSF3 人細(xì)胞裂解液 (陽性對照)
BEEFEXTRACTPOWDER牛肉浸粉**棕黃色至褐色粉末RT不sigma
綠色熒光蛋白標(biāo)記人胃癌細(xì)胞;MGC803-GFP1-二基安基-2-炳醇 1-Dimqthylcmino-2-propcnol 108-16-7
786-O細(xì)胞,人腎透明細(xì)胞腺癌細(xì)胞 小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞,CMT93細(xì)胞 CL-0202Saos-2(人骨肉瘤細(xì)胞)5×106cells/瓶×2D-FRUCTOSED-果糖美國藥典級,歐洲藥典級白色精細(xì)粉末RTsigma
VCaP(人前列腺癌細(xì)胞) 5×106cells/瓶×2化高鐵血紅蛋白參比液150g50張
NHEM.f-c M2 正常人表皮素細(xì)胞(NHEM)少年,M2培養(yǎng)液中培養(yǎng) 500,000cells 視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞Many types of
cells包裝:5 × 105方(1ml)Uracil
50g/100g/250g/500g原裝 Amresco 0847
檢測步驟:
一、 試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX),冰上融化并振蕩混勻后,10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照),每個測試反應(yīng)體系配制如下表:
試劑 每個反應(yīng)加入的量 N個反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14μL N×14μL
酶混合物 1 μL N×1 μL
總量 15 μL N×15μL
諾如病毒GⅡ型試劑盒熒光PCR法(1) 計(jì)算好各試劑的使用量,加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中,充分混勻,10000rpm離心10s,向設(shè)定的N個PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液,向每管中加入處理后樣品或陰性對照(NTC)和陽性對照(BC-PTC)5μL,10000rpm瞬時離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴(kuò)增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時收集熒光信號。報(bào)告基團(tuán):設(shè)置為FAM。淬滅基團(tuán):NONE,請勿選擇ROX參比熒光。