PCR實(shí)驗(yàn)方法步驟：
方法
1：在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。     
10×PCR buffer                   
5 μl     dNTP mix （2mM）             
4 μl     引物1（10pM）                 
2 μl     引物2（10pM）                 
2 μl     Taq酶 （2U/μl）               
1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  
1 μl      加ddH2O至 50 μl  
產(chǎn)品特點(diǎn): 本產(chǎn)品只適用于科研，不能用于臨床診斷
靈敏度高：可檢測個(gè)位拷貝數(shù)的基因
特異性高：有效避免非特異性擴(kuò)增的出現(xiàn)
穩(wěn)定性高：復(fù)孔間差異小，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性強(qiáng)
擴(kuò)增性能優(yōu)：擴(kuò)增效率高，熒光信號強(qiáng)

儲存條件：
僅用于科研14℃或－20℃樣品收集、處理及保存方法
1. 血清：使用不含熱原和內(nèi)**的試管，操作過程中避免任何細(xì)胞刺激，收集血液后，3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。
2. 血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000 轉(zhuǎn)離心30 分鐘取上清。
3. 細(xì)胞上清液：3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘去除顆粒和聚合物。
4. 組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘取上清。
5. 保存：如果樣本收集后不及時(shí)檢測，請按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復(fù)凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

實(shí)驗(yàn)過程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項(xiàng)
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。zui好設(shè)立一個(gè)專用的PCR實(shí)驗(yàn)室。
２．純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險(xiǎn)有大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾高壓。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。

檢測步驟：
一、 試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照)，每個(gè)測試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個(gè)反應(yīng)加入的量 N個(gè)反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14μL N×14μL
酶混合物 1 μL N×1 μL
總量 15 μL N×15μL
（1） 計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對照(NTC)和陽性對照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時(shí)離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴(kuò)增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時(shí)收集熒光信號。報(bào)告基團(tuán)：設(shè)置為FAM。淬滅基團(tuán)：NONE，請勿選擇ROX參比熒光。

大鼠肝細(xì)胞;BRL 膽囊癌細(xì)胞，GBC-SD細(xì)胞 CBRH7919細(xì)胞，大鼠肝癌細(xì)胞(wistar大鼠)氯地孕酮質(zhì)量規(guī)格：美國進(jìn)口Chlormadinone

LncaP, 人前列腺癌細(xì)胞 Human醋酸氯地孕酮-d5質(zhì)量規(guī)格：美國進(jìn)口Chlormadinone-d5 Acetate

LRRTM4 Others Human 人 LRRTM4 人細(xì)胞裂解液 (陽性對照) 可的質(zhì)量規(guī)格：美國進(jìn)口Cortisone

小鼠小腦星形膠質(zhì)細(xì)胞MA-c5-羥-丹曲林質(zhì)量規(guī)格：美國進(jìn)口5-Hydroxy Dantrolene

KITLG Others Mouse 小鼠 SCF / C-kit ligand 桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞裂解液 (陽性對照) 卡鉑-d4質(zhì)量規(guī)格：美國進(jìn)口Carboplatin-d4
IGFBP4 Protein Human 重組人 IGFBP4 蛋白 (His 標(biāo)簽)GTP;鳥苷-5‘-三1酸鈉鹽GTP, 3 Salt質(zhì)量規(guī)格：>90%,分子生物學(xué)級

HFF-1(人成纖維細(xì)胞) 5×106cells/瓶×2 克雷伯肺炎桿菌D-正纈氨酸D-Norvaline質(zhì)量規(guī)格：>98%,BR

臍帶單核細(xì)胞Many types of cells包裝：5 × 105方(1ml)D-苯丙氨酸甲酯鹽酸鹽H-D-Phe-OMe·HCl質(zhì)量規(guī)格：>99%,BR

CSNK2A2 Others Human 人 CSNK2A2 / CK2A2 桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞裂解液 (陽性對照) N-乙酰-D-谷氨酸Ac-D-Glu-OH質(zhì)量規(guī)格：>98%,BR

小鼠瘤細(xì)胞;P388D1(IL-1)CBZ-D-亮氨酸Z-D-Leu-OH 質(zhì)量規(guī)格：BR,>98%,油狀
ICAM1 Others Human 人 ICAM-1 / CD54 人細(xì)胞裂解液 (陽性對照) 4-Bipxenylaceticacid4-聯(lián)25克AR，98%

人肺泡上皮細(xì)胞RNAHPAEpiC miRNA5 μg1,1-二錄烷 1,1-Dichloroqthcnq 72-34-3

FCER1A Others Mouse 小鼠 FcERI / FCER1A 人細(xì)胞裂解液 (陽性對照) 流醋錳;一水合流醋亞錳 Mcngcnqsq Sulfctq ((cS) 10034-96-2

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基 100mL2-硝基shēng huà shì jì容量：RT，避光25克

HSC-T6細(xì)胞，鼠肝星形細(xì)胞 SW620(結(jié)腸癌細(xì)胞) 人前列腺癌低轉(zhuǎn)移細(xì)胞株;PC-3M-2B4544-77-4代十六烷1-IODOHEXADECANE
MAG Others Human 人 MAG / GMA / Siglec-4 人細(xì)胞裂解液 (陽性對照) 葡糖鹽酸鹽，英文名或英文縮寫：D-Glucosamine HC1，級別：高，98%，規(guī)格：10毫克

人甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基 100mL焦鱗醋銅 ; 304671-71-4

Malmc細(xì)胞，人皮膚纖維微細(xì)胞系 光滑 雜交瘤(B類);IB3C10H12A12G2H8F3硼醋(晶須) McGNqSIUM BORcTq 13703-8-7

PPBP Protein Human腸致病性大腸桿菌（EPEC）試劑盒熒光PCR法 重組人 NAP-2 / PPBP / CXCL7 蛋白 (His 標(biāo)簽)沙門氏志賀氏菌增菌液shēng huà shì jì容量：25克

MDA-MB-435S(人導(dǎo)管癌細(xì)胞) 5×106cells/瓶×2 大鼠 PD1 / PDCD1 人細(xì)胞裂解液 (陽性對照) 305-72-6α-酮戊二酸二鈉鹽二水Diwo7ium 2-oxoglutarate dihydrate

產(chǎn)品留言

標(biāo)題

聯(lián)系人

聯(lián)系電話

內(nèi)容

驗(yàn)證碼

點(diǎn)擊換一張

注：1.可以使用快捷鍵Alt+S或Ctrl+Enter發(fā)送信息!
2.如有必要,請您留下您的詳細(xì)聯(lián)系方式!