在目前的以HRP作為標記酶的商品ELISA試劑盒中，如以TMB為底物，則提供的底物為A和B兩瓶應用液；如以OPD為底物，則試劑盒提供OPD片劑或粉劑，臨用前配制。一般商品試劑盒顯色反應條件為37℃或室溫反應15～30分鐘。從理論上說，37℃30分鐘才可以使HRP的底物催化反應完全，盡管在zui 初的10分鐘內，絕大部份催化反應即可完成。因此，為使弱陽性樣本孔能有充分的顯色，建議在37℃下反應25～30分鐘后，終止反應比色測定。

此外，在加入底物開始顯色反應前，zui 好是先檢查一下底物溶液的有效性，即可將A和B兩種液各加一滴于清潔的空板孔或eppendorf管中，觀察是否有顯色出現，如有，則說明底物已變質。以OPD為底物，配好后應為無色，否則就不能使用。以TMB為底物，整個顯色反應過程無需避光，而以OPD為底物，則需避光進行。關于TMB和OPD的顯色反應特點及注意點可參考有關內容。顯色反應完成后，加入酸終止反應，振蕩混勻后即可進行下面的比色測定或肉眼判斷結果。