使用方法:

一、樣品 RNA 的制備

1、用自選方法抽提病毒樣品 RNA。注意：可以選用本公司生產(chǎn)的一管式病毒 RNAout

2、或柱式病毒 RNAout。

二：RT（逆轉(zhuǎn)錄）反應(yīng)合成 cDNA

1. 按下表配制 RT 反應(yīng)體系（20 μL 體系）

2. 70℃保溫 5 分鐘變性模板后立即冰浴。

3. 嚴(yán)格按順序加入 6μL RT Buffer（含 dNTP）和 2μL MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶（含 RI），

反應(yīng)終體積為 20μL。

4. 42℃保溫 60 分鐘。此步為 RT 反應(yīng)。

5. 70℃保溫 10 分鐘以終止反應(yīng)，然后放置在冰上待用。合成的 cDNA 可以直接作為 PCR 模板使用，丌需要純化。

訂購(gòu)信息：

產(chǎn)品名稱：牛源性成分(Bovine)熒光-PCR法

英文名稱：詳見(jiàn)說(shuō)明
貨號(hào)：BJ-01R5027

產(chǎn)品規(guī)格：48T/盒

運(yùn)輸：低溫

保存：負(fù)20度

有效期：一年

貨期：現(xiàn)貨

【儲(chǔ)存條件及有效期】:

-20℃避光保存，避免反復(fù)凍融，有效期6個(gè)月。

【適用儀器】:

ABI7300、ABI7500、LightCycler 480、iCycleriQ5、CFX96、SLAN等熒光定量PCR儀。

【樣本采集、存放及運(yùn)輸】：

u 樣本采集：各類型樣本按照常規(guī)方法采集；

u 存放：樣本在2~8℃條件下保存應(yīng)不超過(guò)72h，-70℃以下可長(zhǎng)期保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融（多凍融3次）；

u 運(yùn)輸：采用**或泡沫箱加冰密封進(jìn)行運(yùn)輸。

本公司產(chǎn)品僅用于科研。

【自備試劑】:

核酸提取試劑，如QIAGEN QIAamp Viral RNA Mini試劑盒，也可選擇其他合適的核酸提取產(chǎn)品。

組成及試劑配制:

1、 酶標(biāo)板：一塊（96孔）

2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請(qǐng)臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。

3、 樣品稀釋液：1×20ml。

4、 檢測(cè)稀釋液A：1×10ml。

5、 檢測(cè)稀釋液B：1×10ml。

實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：

1）RT-PCR可以檢測(cè)組織、細(xì)胞、血液、等很多材料，不同的樣本有不同要求，實(shí)驗(yàn)前請(qǐng)充分溝通確認(rèn)實(shí)驗(yàn)方案和樣本情況；

2）客戶盡可能提供實(shí)驗(yàn)的背景信息、物種、基因準(zhǔn)確的名稱和ID號(hào)；

3）客戶盡量不要提供DNA或RNA樣品。

4）樣本保存于液氮或干冰，也可以保存于Trizol液中。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。實(shí)時(shí)熒光定量PCR的化學(xué)原理包括探針類和非探針類兩類，探針類是利用與靶細(xì)胞序列特異性雜交的探針來(lái)指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，非探針類是利用熒光染料或者特異性設(shè)計(jì)的引物來(lái)指示擴(kuò)增的增加。運(yùn)用該技術(shù)可以對(duì)DNA、RNA樣品進(jìn)行定量（包括量和相對(duì)定量）和定性分析。

主要服務(wù)：DNA或RNA的定量分析、基因表達(dá)差異分析、基因分型。

主要技術(shù)：引物設(shè)計(jì)、RNA提取、cDNA合成、qPCR。

PCR反應(yīng)的特異性決定因素為：

①引物與模板DNA特異正確的結(jié)合；

②堿基配對(duì)原則；

③Taq DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性；

④靶基因的特異性與保守性。

其中引物與模板的正確結(jié)合是關(guān)鍵。引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對(duì)原則的。聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性及Taq DNA聚合酶耐高溫性，使反應(yīng)中模板與引物的結(jié)合(復(fù)性)可以在較高的溫度下進(jìn)行，結(jié)合的特異性大大增加，被擴(kuò)增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過(guò)選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū)，其特異性程度就更高。

(2) 靈敏度高

PCR產(chǎn)物的**量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克(pg=10-12g)量級(jí)的起始待測(cè)模板擴(kuò)增到微克(ug=10-6g)水平。能從100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞；在病毒的檢測(cè)中，PCR的靈敏度可達(dá)3個(gè)RFU(空斑形成單位)；在學(xué)中zui小檢出率為3個(gè)。

(3) 簡(jiǎn)便、快速

PCR反應(yīng)用耐高溫的Taq DNA聚合酶，一次性地將反應(yīng)液加好后，即在DNA擴(kuò)增液和水浴鍋上進(jìn)行變性-退火-延伸反應(yīng)，一般在2～4 小時(shí)完成擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無(wú)放射性污染、易推廣。

(4) 對(duì)標(biāo)本的純度要求低

不需要分離病毒或及培養(yǎng)細(xì)胞，DNA 粗制品及總RNA均可作為擴(kuò)增模板?？芍苯佑门R床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活PCR技術(shù)概論。

H-His(Trt)-2-Chlorotrityl Resin  1mg  StemRegenin 1 (SR1)  10mg    

Pardoprunox (SLV-308)  500μg  UNC0321  5g    

NIM811 ((Melle-4)cyclosporin)  5μg  Chebulagic acid  100mg    

XL-784 free base  25g  Tyramine-d4 (hydrochloride)  10mM*1mLinWater    

INK1117  25g  Prochlorperazine (maleate)  10mg    

Veratraldehyde  1mg  EED Human  50mg    

CCX140  50mg  HAV P2C-P3B  25g    

(D-Trp11)-Neurotensin  5mg  Talabostat isomer mesylate  1mg    

Myoglobin His Human  10mg  Bcl 2 Human (minus BH3 domain)  5mg    

HPV 6  10mg  T4 DNA  5mg    

Lapaquistat  1mg  CD28 Human  50mg    

RGS5 Human  20μg  MDL 105519  1mg    

XPA Human  10mg  IL 1RA Human  100μg    

GALE Human  50mg  Rabacfosadine (GS-9219)  5μg    

TANK Human  1mg  Pimobendan hydrochloride  5mg    

牛源性成分(Bovine)熒光-PCR法6,7-Dimethoxyquinolin-4-ol  中文名稱：4-羥基-6,7-二甲氧基喹啉CAS號(hào)：13425-93-9中文別名：4-羥基-6,7-二甲氧基喹啉;6,7-二甲氧基-4-羥基喹啉;2-叔丁基-4-

(2R)-2-(phenylmethoxycarbonylamino)propanoic acid  中文名稱：Cbz-D-丙氨酸CAS號(hào)：26607-51-2中文別名：Cbz-D-丙氨酸;N-芐氧羰基-D-丙氨酸;N-CBZ-D-丙氨酸;(R)-2-(((芐氧

2-AMino-4,5-bis((4-Methoxybenzyl)oxy)benzoic acid  中文名稱：2-Amino-4,5-bis((4-methoxybenzyl)oxy)benzoic acidCAS號(hào)：1609073-29-1中文別名：2-氨基

Spiro[furo[3,4-c]pyridine-3(1H),4'-piperidin]-1-one hydrochlorid  中文名稱：螺[呋喃并[3,4-c]吡啶-3(1H),4'-啶]-1-酮鹽酸鹽CAS號(hào)：475152-16-0中文別名：螺[呋喃并[3,4-c]吡啶-3(1H)

DC037021  英文別名：6H-Benzo[g]-1,3-benzodioxolo[5,6-a]quinolizine,5,8,13,13a-tetrahydro-10,11-

2-amino-6-methyl-4-chloro-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidine  中文名稱：CAS號(hào)：204929-06-6中文別名：英文名稱：4-chloro-6-methyl-7H-Pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-2-am

(3R,4R,6aR)-tert-butyl-(5-fluoro-2,2-dimethyl-6-trityloxymethyl-4,6a-dihydro-3aH-cyclopenta[1,3]dioxol-4-yloxy)-diphenyl-silane  中文名稱：RX-3117中間體CAS號(hào)：805245-41-4中文別名：(((3aR,4R,6aR)-5-氟-2,2-二甲基-6-((甲苯磺酰氧基)甲基)-4,

2-ethoxy-5-(4-ethylpiperazin-1-yl)sulfonylbenzoic acid  

N-(trans-4-phenylcyclohexyl)-Carbamic acid 1,1-dimethylethyl ester  中文別名：N-(trans-4-phenylcyclohexyl)-Carbamic acid 1,1-dimethylethyl ester 英文名稱：N-(

N-[2-(4-bromophenyl)ethyl]-2-methylpropanamide  中文名稱：N-[2-(4-Bromophenyl)ethyl]-2-methylpropanamideCAS號(hào)：304664-15-1中文別名：N-(4-硝基苯

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