一、 陽(yáng)性對(duì)照

可使用已知含有目標(biāo)蛋白的內(nèi)源性可溶樣品，或已知含有檢測(cè)抗體免yi原的純化蛋白或多肽來(lái)作為陽(yáng)性對(duì)照。當(dāng)樣品的檢測(cè)結(jié)果為陰性時(shí)，陽(yáng)性對(duì)照的陽(yáng)性結(jié)果可表明實(shí)驗(yàn)過(guò)程無(wú)誤且有效，所以實(shí)驗(yàn)的陰性結(jié)果是真實(shí)的。

我們建議閱讀抗體的產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)，通常其中會(huì)有適合的陽(yáng)性對(duì)照推薦。如果沒(méi)有對(duì)照推薦，我們建議如下：

檢查抗體是否存在任何 Abreviews®。成功實(shí)驗(yàn)結(jié)果中所使用的任何組織、細(xì)胞或裂解物均可被視為適合的陽(yáng)性對(duì)照。

打開(kāi)說(shuō)明書(shū)上的 Swiss-Prot  或 Omnigene 數(shù)據(jù)庫(kù)鏈接。這些數(shù)據(jù)庫(kù)通常會(huì)有蛋白表達(dá)水平的組織列表。高表達(dá)的組織也可被視為陽(yáng)性對(duì)照。

在 GeneCards 中搜索目標(biāo)蛋白。這里通常會(huì)為您提供各種組織中目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。

如果您仍然難以找到合適的對(duì)照，我們建議在 PubMed 上進(jìn)行一次快速的文獻(xiàn)檢索，查看哪些組織和細(xì)胞表達(dá)目標(biāo)蛋白。

二、陰性對(duì)照

陰性對(duì)照指的是已知不表達(dá)目標(biāo)蛋白的樣品。其有助于檢測(cè)非特異性結(jié)合和假陽(yáng)性結(jié)果。為驗(yàn)證結(jié)果，您使用的每個(gè)微孔板均應(yīng)包含一份陰性對(duì)照樣品。

三、標(biāo)準(zhǔn)品

標(biāo)準(zhǔn)品是一種含有已知濃度的目標(biāo)蛋白的樣品，可從中獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線。例如，以下是我們的小鼠 IL6 ELISA 試劑盒的典型標(biāo)準(zhǔn)曲線，濃度范圍為 15.6 至 500 pg/mL。標(biāo)準(zhǔn)曲線不佳意味著抗體未正確結(jié)合或未捕獲蛋白標(biāo)準(zhǔn)品。趨勢(shì)線的 R2 值應(yīng) > 0.99。

四、樣本基質(zhì)（加標(biāo)對(duì)照品）對(duì)照中的標(biāo)準(zhǔn)品

在 ELISA 中檢測(cè)血清樣品時(shí)，按照慣例標(biāo)準(zhǔn)品用正常稀釋緩沖液來(lái)稀釋。但我們建議您同時(shí)用檢測(cè)的種屬血清來(lái)稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。然后可以將兩者進(jìn)行比較，以確保血清中的其他蛋白質(zhì)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線沒(méi)有影響。這就是所謂的加標(biāo)對(duì)照，并可表明目標(biāo)蛋白在加入基質(zhì)后的回收率?？山邮艿慕Y(jié)果為 80%-120%。

五、內(nèi)源性陽(yáng)性對(duì)照

如果您正在檢測(cè)重組蛋白樣品，我們建議您納入內(nèi)源性陽(yáng)性對(duì)照。這應(yīng)該是您實(shí)驗(yàn)的一個(gè)必要部分。

重組蛋白的抗體檢測(cè)存在一些固有的困難，需要考慮到重組蛋白的折疊可能與內(nèi)源性天然蛋白的結(jié)構(gòu)不同，并可能阻止抗體結(jié)合表位。標(biāo)簽蛋白的情況尤其如此，所以建議確保標(biāo)簽位于重組蛋白的N端或C端。

*重要的是，務(wù)必確保重組蛋白中包括您所使用的抗體的免yi原序列。內(nèi)源性陽(yáng)性對(duì)照對(duì)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以及說(shuō)明試劑（例如抗體）和實(shí)驗(yàn)過(guò)程的有效性，起到重要作用。