深圳菲特立科技有限公司推出德國**微生物快速檢測系統(tǒng)RVLM ,可快速定量的檢測各類致病菌。詳情請登陸www.szfitly.com
本標準代替GB/T 4789.38-2008 《食品衛(wèi)生微生物學檢驗大腸桿菌計數》。
本標準與GB/T 4789.38-2008相比,主要變化如下:
——修改了標準的中文名稱;
——修改了培養(yǎng)基和試劑;
——將“**法大腸桿菌VRB-MUG平板計數法”改為“大腸埃希氏菌平板計數法(**法)”;
——刪除了“第三法大腸桿菌PetrifilmTM測試片計數法”;
——修改了附錄A。
食品**國家標準
《食品微生物學檢驗 大腸埃希氏菌計數》
1 范圍
本標準規(guī)定了食品中大腸埃希氏菌(Escherichia coli)計數的方法。
本標準適用于食品中大腸埃希氏菌的計數,其中大腸埃希氏菌平板計數法(**法)不適用于貝類產品。
2 術語和定義
2.1 大腸埃希氏菌 Escherichia coli
大腸桿菌 廣泛存在于人和溫血動物的腸道中,能夠在44.5℃發(fā)酵乳糖產酸產氣,IMViC(靛基質、甲基紅、VP試驗、檸檬酸鹽)生化試驗為++--或-+--的革蘭氏陰性桿菌。以此作為糞便污染指標來評價食品的衛(wèi)生狀況,推斷食品中腸道致病菌污染的可能性。
2.2 *可能數
基于泊松分布的一種間接計數方法,簡稱為MPN。
3 設備和材料
除微生物實驗室常規(guī)**及培養(yǎng)設備外,其他設備和材料如下:
a)恒溫培養(yǎng)箱:36℃±1℃;
b)冰箱:2℃~5℃;
c)恒溫水浴箱:44.5℃±0.2℃;
d)天平:感量為0.1g;
c)均質器;
d)振蕩器;
e)無菌吸管:1 mL(具0.01 mL刻度)、10 mL(具0.1 mL刻度)或微量移液器及吸頭;
f)無菌錐形瓶:容量500 mL;
g)無菌培養(yǎng)皿:直徑90 mm;
h)pH計或pH比色管或精密pH試紙;
i)菌落計數器;
j)紫外燈:波長360nm~366nm,功率≤6 W。
4 培養(yǎng)基和試劑
4.1月桂基硫酸鹽胰蛋白胨(LST)肉湯:見附錄A中A.1。
4.2EC肉湯(E.coli broth):見附錄A中A.2。
4.3蛋白胨水:見附錄A中A.3。
4.4緩沖葡萄糖蛋白胨水[甲基紅(MR)和V-P試驗用]:見附錄A中A.4。
4.5 西蒙氏檸檬酸鹽培養(yǎng)基:見附錄A中A.5。
4.6 磷酸鹽緩沖液:見附錄A中A.6。
4.7 伊紅美藍(EMB)瓊脂:見附錄A中A.7。
4.8 營養(yǎng)瓊脂斜面:見附錄A中A.8。
4.9 結晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBA):見附錄A中A.9。
4.10 結晶紫中性紅膽鹽-4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖苷瓊脂(VRBA-MUG):見附錄A中A.10。
4.11 革蘭氏染色液:見附錄A中A.11。
4.12 Kovacs靛基質試劑:見附錄A中A.12。
4.13無菌1mol/L NaOH:見附錄A中A.13。
4.14無菌1mol/L HCl:見附錄A中A.14。
5 大腸埃希氏菌MPN計數(**法)
5.1 檢驗程序
大腸埃希氏菌MPN計數的檢驗程序見圖1。
5.2 操作步驟
5.2.1 樣品的稀釋
5.2.1.1 固體和半固體樣品:稱取25g樣品,放入盛有225mL磷酸鹽緩沖液的無菌均質杯內,8 000 r/min~10 000 r/min均質1 min~2 min,制成1:10樣品勻液,或放入盛有225mL磷酸鹽緩沖液的無菌均質袋中,用拍擊式均質器拍打1 min~2 min制成1:10的樣品勻液。
5.2.1.2 液體樣品:以無菌吸管吸取25mL樣品置盛有225mL磷酸鹽緩沖液的無菌錐形瓶(瓶內預置適當數量的無菌玻璃珠)中,充分混勻,制成1:10的樣品勻液。
5.2.1.3 樣品勻液的pH值應在6.5~7.5之間,必要時分別用1 mol/LNaOH或1 mol/L HCl調節(jié)。
5.2.1.4 用1 mL無菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1mL,沿管壁緩緩注入9mL磷酸鹽緩沖液的無菌試管中(注意吸管或吸頭**不要觸及稀釋液面),振搖試管或換用1支1 mL無菌吸管或吸頭反復吹打,使其混合均勻,制成1:100的樣品勻液。
5.2.1.5 根據對樣品污染狀況的估計,按上述操作,依次制成10倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1次,換用1支1 mL無菌吸管或吸頭。從制備樣品勻液至樣品接種完畢,全過程不得超過15 min。
5.2.2 初發(fā)酵試驗
每個樣品,選擇3個適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液(液體樣品可以選擇原液),每個稀釋度接種3管月桂基硫酸鹽胰蛋白胨(LST)肉湯,每管接種1 mL(如接種量超過1mL,則用雙料LST肉湯),36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h,觀察小倒管內是否有氣泡產生,24h±2h產氣者進行復發(fā)酵試驗,如未產氣則繼續(xù)培養(yǎng)48h±2h。產氣者進行復發(fā)酵試驗。如所有LST肉湯管均未產氣,即可報告大腸埃希氏菌MPN結果。
5.2.3 復發(fā)酵試驗
用接種環(huán)從產氣的LST肉湯管中分別取培養(yǎng)物1環(huán),移種于已提前預溫至45℃的EC肉湯管中,放入帶蓋的44.5℃±0.2℃水浴箱內。水浴的水面應高于肉湯培養(yǎng)基液面,培養(yǎng)24h±2h,檢查小倒管內是否有氣泡產生,如未有產氣則繼續(xù)培養(yǎng)至48h±2h。記錄在24h和48h內產氣的EC肉湯管數。如所有EC肉湯管均未產氣,即可報告大腸埃希氏菌MPN結果;如有產氣者,則進行EMB平板分離培養(yǎng)。
5.2.4 伊紅美藍平板分離培養(yǎng)
輕輕振搖各產氣管,用接種環(huán)取培養(yǎng)物分別劃線接種于EMB平板,36℃±1℃培養(yǎng)18h~24h。觀察平板上有無具黑色中心有光澤或無光澤的典型菌落。
5.2.5 營養(yǎng)瓊脂斜面或平板培養(yǎng)
從每個平板上挑5個典型菌落,如無典型菌落則挑取可疑菌落。用接種針接觸菌落中心部位,移種到營養(yǎng)瓊脂斜面或平板上,36℃±1℃,培養(yǎng)18h~24h。取培養(yǎng)物進行革蘭氏染色和生化試驗。
5.2.6 鑒定
取培養(yǎng)物進行靛基質試驗、MR-VP試驗和檸檬酸鹽利用試驗。大腸埃希氏菌與非大腸埃希氏菌的生化鑒別見表1。
5.3 大腸埃希氏菌MPN 計數的報告
大腸埃希氏菌為革蘭氏陰性無芽胞桿菌,發(fā)酵乳糖、產酸、產氣,IMViC生化試驗為++――或-+--。只要有1個菌落鑒定為大腸埃希氏菌,其所代表的LST肉湯管即為大腸埃希氏菌陽性。依據LST肉湯陽性管數查MPN表(見附錄B),報告每g(mL)樣品中大腸埃希氏菌MPN值。
6 大腸埃希氏菌平板計數法(**法)
6.1 檢驗程序
大腸埃希氏菌平板計數法的檢驗程序見圖2。
6.2操作步驟
6.2.1 樣品的稀釋
按5.2.1進行。
6.2.2 平板計數
6.2.2.1 選取2個~3個適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液,每個稀釋度接種2個無菌平皿,每皿1 mL。同時取1 mL稀釋液加入無菌平皿做空白對照。
6.2.2.2 將10mL~15mL冷至45℃±0.5℃的結晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBA)傾注于每個平皿中。小心旋轉平皿,將培養(yǎng)基與樣品勻液充分混勻。待瓊脂凝固后,再加3 mL~4 mLVRBA-MUG覆蓋平板表層。凝固后翻轉平板,36℃±1℃培養(yǎng)18 h~24 h。
6.3 平板菌落數的選擇
選擇菌落數在10CFU~100CFU之間的平板,暗室中360 nm~366 nm 波長紫外燈照射下,計數平板上發(fā)淺藍色熒光的菌落。
檢驗時用已知MUG陽性菌株(如大腸埃希氏菌ATCC 25922)和產氣腸桿菌(如ATCC 13048)做陽性和陰性對照。
6.4 大腸埃希氏菌平板計數的報告
兩個平板上發(fā)熒光菌落數的平均數乘以稀釋倍數,報告每g(mL)樣品中大腸埃希氏菌數,以CFU/g (mL)表示。若所有稀釋度(包括液體樣品原液)平板均無菌落生長,則以小于1乘以*低稀釋倍數報告。