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一，使用方法概述
1.分光光度法定義與應(yīng)用
1.1定義:分光光度法是利用物質(zhì)所特有的吸收光譜來鑒別物質(zhì)或測(cè)定其含量的分析檢測(cè)技術(shù).
1.2特點(diǎn):靈敏,**,快速和簡(jiǎn)便,在復(fù)雜組分系統(tǒng)中,不需要分離,即能檢測(cè)出其中所含的極少量物質(zhì).
1.3應(yīng)用:生物，化學(xué)研究中廣泛使用的方法之一,廣泛用于糖,蛋白質(zhì),核酸,酶等的快速定量檢測(cè). 。
2.分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)和工作原理
2.1分光光度計(jì)的分類
紅外分光光度計(jì):測(cè)定波長(zhǎng)范圍為大于760 nm的紅外光區(qū)
可見光分光光度計(jì):測(cè)定波長(zhǎng)范圍為400~760 nm的可見光區(qū)
紫外分光光度計(jì):測(cè)定波長(zhǎng)范圍為200～400 nm的紫外光區(qū)
2.2分光光度計(jì)工作原理
人眼可見的光只占電磁波譜的很小—部分(400~760nm)
它是一種頻率較大的電磁波.電磁波按頻率大小,從頻率*小的無線電波到頻率*大的γ-射線排成一列,即組成電磁波的波譜。
2.2.1分光光度計(jì)的光譜范圍
包括波長(zhǎng)范圍為400~760 nm的可見光區(qū)和波長(zhǎng)范圍為200～400 nm的紫外光區(qū).不同的光源都有其特有的發(fā)射光譜,因此可采用不同的發(fā)光體作為儀器的光源. 鎢燈的發(fā)射光譜:鎢燈光源所發(fā)出的400～760nm波長(zhǎng)的光譜,光通過三棱鏡折射后,可得到由紅,橙,黃,綠,藍(lán),靛,紫組成的連續(xù)色譜;該色譜可作為可見光分光光度計(jì)的光源. 氘燈的發(fā)射光譜:氫燈能發(fā)出185～400 nm波長(zhǎng)的光譜,可作為紫外光光度計(jì)的光源.
2.2.2物質(zhì)的吸收光譜(1)
如果在光源和棱鏡之間放上某種物質(zhì)的溶液,此時(shí)在屏上所顯示的光譜已不再是光源的光譜,它出現(xiàn)了幾條暗線,即光源發(fā)射光譜中某些波長(zhǎng)的光因溶液吸收而消失,這種被溶液吸收后的光譜稱為該溶液的吸收光譜. 不同物質(zhì)的吸收光譜是不同的.因此根據(jù)吸收光譜,可以鑒別溶液中所含的物質(zhì).
2.2.2物質(zhì)的吸收光譜(2)
當(dāng)光線通過某種物質(zhì)的溶液時(shí),透過的光的強(qiáng)度減弱.因?yàn)橛幸徊糠止庠谌芤旱谋砻娣瓷浠蚍稚?一部分光被組成此溶液的物質(zhì)所吸收,只有一部分光可透過溶液. 入射光=反射光+分散光+吸收光+透過光 如果我們用蒸餾水(或組成此溶液的溶劑)作為"空白"去校正反射,分散等因素造成的入射光的損失,則: 入射光=吸收光十透過光
2.2.3物質(zhì)吸光度(A)與透射比(T)的關(guān)系
物質(zhì)的吸光度與吸收物質(zhì)的濃度和液層的厚度成正比,這就是光吸收的基本定律-- 朗伯-比耳定律.
2.3分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)
無論哪一類分光光度計(jì)都包括:光源,單色器,吸收池,檢測(cè)器和測(cè)量?jī)x表. 分光光度計(jì)的基本部件
(1):光源:分光光度計(jì)上常用的光源有兩種:鎢絲燈或氫燈,在可見光區(qū),近紫外光區(qū)和近紅外光區(qū)常用鎢絲燈作為光源;在紫外光區(qū)多使用氫弧燈.
單色器:把混合光波分解為單—波長(zhǎng)光的裝置.在分光光度計(jì)中多用作為色散元件. 吸收池比色杯,比色皿,比色池)一般由玻璃,石英或熔凝石英制成,用來盛被測(cè)的溶液.在低于350 nm的紫外光區(qū)工作時(shí),必須采用石英池或熔凝石英池. 分光光度計(jì)的基本部件:
(2)吸收池(比色皿)必須與光束方向垂直.此外,每套比色皿的質(zhì)料,厚度應(yīng)完全相同,以免產(chǎn)生誤差.比色皿上的指紋,油污或壁上的沉積物都會(huì)顯著地影響其透光性,因此在使用前務(wù)必徹底清洗. 常用光電池,光電管和光電倍增管三種. 測(cè)量裝置 —般常用的紫外光和可見光分光光度計(jì)有3種測(cè)量裝置,即電流表,記錄器和數(shù)字示值讀數(shù)單元.現(xiàn)代的儀器常附有自動(dòng)記錄器,可自動(dòng)描出吸收曲線.
(3)檢測(cè)器 ：
棱鏡與光柵 棱鏡:光波通過棱鏡時(shí),不同波長(zhǎng)的光折射率不同;因而能將不同波長(zhǎng)的光分開.玻璃對(duì)紫外線的吸收力強(qiáng),故玻璃棱鏡多用于可見光分光光度計(jì).石英棱鏡可在整個(gè)紫外光區(qū)傳播光,故在紫外光分光光度計(jì)中廣為應(yīng)用. 衍射光柵:在石英或玻璃表面上刻劃許多平行線(每英寸約刻15000—30000條).由于刻線處不透光,通過光的干涉和衍射使較長(zhǎng)的光波偏折角度大,較短的光波偏折角度小,因而形成光譜. 光源照到棱鏡(或光柵)以前,先要經(jīng)過一個(gè)入射狹縫,再通過平行光鏡使成為平行光束投到棱鏡上.透過棱鏡的光再經(jīng)另一聚光鏡,在此聚光鏡的焦面內(nèi)可得一清楚的光譜圖.如在焦線處放—出射狹縫,轉(zhuǎn)動(dòng)棱鏡使光譜移動(dòng),就可以從出射狹縫射出所需要的單色光.整個(gè)裝置稱為"單色器" 光電池 。
光電池裝在一個(gè)特制的匣子里面由3層物質(zhì)組成的圓形或長(zhǎng)方形薄片.**層是一種導(dǎo)電性良好的金屬,這是光電池的負(fù)極.中間極薄的一層是半導(dǎo)體硒,第3層是鐵,這是光電池的正極.當(dāng)光電池受光照射以后,半導(dǎo)體硒的表面逸出電子,這些電子只向負(fù)極方向移動(dòng),而不向正極移動(dòng),因此在上下兩金屬片間產(chǎn)生一個(gè)電位差,線路 連通時(shí)即產(chǎn)生電流
光電管
光電管是由封裝在真空透明封套里的一個(gè)半圓柱型陰極和一個(gè)絲陽極組成.陰極的凹畫上有一層光電發(fā)射材料,此種物質(zhì)經(jīng)光照射可發(fā)射電子.當(dāng)在兩極間加有電位 時(shí),發(fā)射出來的電子就流向絲陽極而產(chǎn)生光電流.對(duì)于相同的輻射強(qiáng)度,它所產(chǎn)生的電流約為光電池所產(chǎn)生電流的1/4.由于光電管具有很高的電阻,所以產(chǎn)生的 電流容易放大.
光電倍增管
它比普通的光電管優(yōu)越,它可將**次發(fā)射出的電子數(shù)目放大到數(shù)百萬倍.當(dāng)電子打在兼性陽極上時(shí),能引起更多的電子自表面射出.這些射出的電子又被**個(gè)兼性陽極所吸引,同樣再產(chǎn)生更多的電子.
此過程重復(fù)9次后,每個(gè)光子可形成106~107個(gè)電子.這些電子*后被收集在陽極上.所得到的倍增電流可進(jìn)一步加以放大和測(cè)量.
二，分光光度計(jì)的使用及維護(hù)
在日常使用及維護(hù)當(dāng)中應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：
**，在使用儀器前，必須仔細(xì)閱讀其使用說明書。
**，若大幅度改變測(cè)試波長(zhǎng)，需稍等片刻，等燈熱平衡后，重新調(diào)零及滿度后，再測(cè)量。
第三，指針式儀器在未接通電源時(shí)，電表的指針必須位于零刻度上。若不是這種情況，需進(jìn)行機(jī)械調(diào)零。
第四，操作人員不應(yīng)輕易觸動(dòng)燈泡及反光鏡燈，以免影響光效率。
第五，放大器靈敏度換擋后，必須重新調(diào)零。
第六，比色皿使用時(shí)要注意其方向性，并應(yīng)配套使用，以延長(zhǎng)其使用壽命。新的比色皿使用前必須進(jìn)行配對(duì)選擇，測(cè)定其相對(duì)厚度，互相偏差不得超過2%透光度，否則影響測(cè)定結(jié)果。使用完畢后，請(qǐng)立即用蒸餾水沖洗干凈（測(cè)定有色溶液后，應(yīng)先用相應(yīng)的溶劑或（1+3）的硝酸進(jìn)行浸泡，浸泡時(shí)間不宜過長(zhǎng)，再用蒸餾水沖洗干凈），并用干凈柔軟的紗布將水跡擦去，以防止表面光潔度被破壞，影響比色皿的透光率。
第七，比色皿架及比色皿在使用中的正確到位問題。首先，應(yīng)保證比色皿不傾斜。因?yàn)樯栽S傾斜，就會(huì)使參比樣品與待測(cè)樣品的吸收光徑長(zhǎng)度不一致，還有可能使入射光不能全部通過樣品池，導(dǎo)致測(cè)試準(zhǔn)確度不符合要求。其次，應(yīng)保證每次測(cè)試時(shí)，比色皿架推拉到位。若不到位，將影響到測(cè)試值的重復(fù)性或準(zhǔn)確度。
第八，干燥劑的使用問題。干燥劑失效將會(huì)導(dǎo)致以下問題：①數(shù)顯不穩(wěn)，無法調(diào)零或滿度。②反射鏡發(fā)霉或沾污，影響光效率，雜散光增加。因此分光光度計(jì)應(yīng)放置在遠(yuǎn)離水池等濕度大的地方，并且干燥劑應(yīng)定期更換或烘烤。
第九，分光光度計(jì)的放置位置應(yīng)符合以下條件：避免陽光直射；避免強(qiáng)電場(chǎng)；避免與較大功率的電器設(shè)備共電；避開腐蝕性氣體等。
三，常見故障排除
在分光光度計(jì)的實(shí)際操作過程中，*容易出現(xiàn)的幾個(gè)典型故障是：①儀器不能調(diào)零；②儀器不能調(diào)“100%”；③測(cè)量過程中，“100%”點(diǎn)經(jīng)常變動(dòng)；④數(shù)顯不穩(wěn)。
故障類型：儀器不能調(diào)零
原因：儀器嚴(yán)重受潮 電路故障 光門不能完全關(guān)閉
排除方法：可打開光電管暗盒，用電吹風(fēng)吹上一會(huì)兒使其干燥，并更換干燥劑；修復(fù)光門部件，使其完全關(guān)閉；??修理部門，檢修電路
故障類型：儀器不能調(diào)“100%”光能量不夠
原因：比色皿架未落位；光電轉(zhuǎn)換部分老化；電路故障
排除方法：增加靈敏度倍率檔位，或調(diào)整光源燈的位置。若光源燈變黑，說明光源燈已老化，更換光源燈；調(diào)整比色皿架使其落位，更換部件；送修理部門，檢修電路
故障類型：測(cè)量過程中,“100%”點(diǎn)經(jīng)常變動(dòng)
原因：比色皿在比色皿架中放置的位置不一致，或其表面有液滴；電路故障
排除方法：用擦鏡紙擦干凈比色皿表面，然后將其安放在比色槽的左邊，上面用定位夾定位；送修理部門，檢修電路
故障類型：數(shù)顯不穩(wěn)
原因：預(yù)熱時(shí)間不夠；光電管內(nèi)的干燥劑失效，使微電流放大器受潮；光電管老化、電路等其它原因；光源燈問題；操作不當(dāng)；環(huán)境振動(dòng)過大、光源附近空氣流速大、外界強(qiáng)光照射等；
排除方法： 延長(zhǎng)預(yù)熱時(shí)間至30分鐘左右（部分儀器由于老化等原因，長(zhǎng)時(shí)間處于工作狀態(tài)時(shí)，也會(huì)工作不穩(wěn)）；烘烤電路，并更換或烘烤干燥劑；改善工作環(huán)境；更換相同的光電管或送修；光源燈不穩(wěn)定，更換光源燈，更換時(shí)注意防止燈泡污染；注意操作規(guī)范，按照使用說明書要求進(jìn)行操作。
總之，分光光度計(jì)是一種精密的分析儀器，在其使用過程中應(yīng)嚴(yán)格遵守其操作規(guī)范，按照使用說明書正確進(jìn)行操作，并做好日常維護(hù)工作，以保證分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。
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