直接**熒光法的注意事項

?  對熒光標(biāo)記的抗體的稀釋：要抗體的蛋白有的濃度；

?  一般稀釋度不應(yīng)超過1:20，抗體濃度過低，會導(dǎo)致產(chǎn)生的熒光過弱，影響結(jié)果的觀察。

?  染色溫度和時間需要根據(jù)各種不同的標(biāo)本及抗原而變化；

–  染色時間：從10 min到數(shù)小時，一般30 min

–  染色溫度：多采用室溫(25?C)，高于37?C可加強染色效果，但對不耐熱的抗原(如流行性乙型腦炎病毒)可采用0-2?C的低溫，延長染色時間

–  低溫染色過夜較37 ?C 30 min效果好的多。

?  試驗時需設(shè)置下列對照：

–  自發(fā)熒光對照(空白對照)：標(biāo)本加0.01mol/L，pH7.4的PBS代替一抗。

–  陽性對照：用已知的陽性標(biāo)本加熒光標(biāo)記的特異性抗體。

–  特異性對照(抑制試驗)：標(biāo)本加未標(biāo)記的特異性抗體，再加熒光標(biāo)記的特異性抗體。

?  若標(biāo)本自發(fā)熒光對照和特異性對照呈無熒光或弱熒光，陽性對照和待檢標(biāo)本呈強熒光，則為特異性陽性染色。

?  一般標(biāo)本在高壓汞燈下照射超過3min，就有熒光減弱現(xiàn)象；

?  經(jīng)熒光染色的標(biāo)本在當(dāng)天觀察，隨著時間的延長，熒光強度會逐漸下降。

2 間接法又稱為熒光抗-抗體法

  需要兩種抗體參與，即一抗和二抗(熒光素標(biāo)記)。一抗對標(biāo)本中的抗原來說起抗體的作用，但對熒光標(biāo)記的二抗來說又起著抗原作用。

   可用來檢測標(biāo)本中未知抗原，也可檢測血清中未知抗體。

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