蛋白鑒定方法之與質(zhì)譜相關(guān)的技術(shù)
質(zhì)譜已成為連接蛋白質(zhì)與基因的重要技術(shù)，開啟了大規(guī)模自動化的蛋白質(zhì)鑒定之門。 用來分析蛋白質(zhì)或多肽的質(zhì)譜有兩個主要的部分，1）樣品入機(jī)的離子源，2）測量被介入離子的分子量的裝置。 是基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF）為一脈沖式的離子化技術(shù)。 它從固相標(biāo)本中產(chǎn)生離子，并在飛行管中測其分子量。 其次是電噴霧質(zhì)譜（ESI-MS），是一連續(xù)離子化的方法，從液相中產(chǎn)生離子，聯(lián)合四極質(zhì)譜或在飛行時間檢測器中測其分子量。 近年來，質(zhì)譜的裝置和技術(shù)有了長足的進(jìn)展。
在MALDI-TOF中，重要的進(jìn)步是離子反射器（ion reflectron）和延遲提?。╠elayed ion extraction），可達(dá)相當(dāng)?shù)姆肿恿俊?在ESI-MS中，納米級電霧源（nano-electrospray source）的出現(xiàn)使得微升級的樣品在30～40 min內(nèi)分析成為可能。
將反相液相色譜和串聯(lián)質(zhì)譜（tandem MS）聯(lián)用，可在數(shù)十個picomole的水平檢測；若利用毛細(xì)管色譜與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用，則可在低picomole到高femtomole水平檢測；當(dāng)利用毛細(xì)管電泳與串聯(lián)質(zhì)譜連用時，可在小于femtomole的水平檢測。 甚至可在attomole水平進(jìn)行。 目前多為酶解、液相色譜分離、串聯(lián)質(zhì)譜及計算機(jī)算法的聯(lián)合應(yīng)用鑒定蛋白質(zhì)。 下面以肽質(zhì)指紋術(shù)和肽片段的測序來說明怎樣通過質(zhì)譜來鑒定蛋白質(zhì)。
(1)肽質(zhì)指紋術(shù)（peptide mass fingerprint， PMF）
由Henzel等人于1993年提出。 用酶（常用的是胰酶）對由2-DE分離的蛋白在膠上或在膜上于精氨酸或賴氨酸的C-末端處進(jìn)行斷裂，斷裂所產(chǎn)生的的分子量通過質(zhì)譜來測量（MALDI-TOF-MS，或為ESI-MS），這一技術(shù)能夠完成的肽質(zhì)量可到0。1個分子量單位。 所有的肽質(zhì)量后與數(shù)據(jù)庫中理論肽質(zhì)量相配比（理論肽是由實驗所用的酶來“斷裂”蛋白所產(chǎn)生的）。 配比的結(jié)果是按照數(shù)據(jù)庫中肽片段與未知蛋白共有的肽片段數(shù)目作一排行榜，“**”肽片段可能代表一個未知蛋白。若冠亞軍之間的肽片段存在較大差異，且這個蛋白可與實驗所示的肽片段覆蓋良好，則說明正確鑒定的可能性較大。
(2)肽片段（peptide fragment）的部分測序
肽質(zhì)指紋術(shù)對其自身而言，不能揭示所衍生的肽片段或蛋白質(zhì)。 為進(jìn)一步鑒定蛋白質(zhì)，出現(xiàn)了一系列的質(zhì)譜方法用來描述肽片段。 用酶或化學(xué)方法從N-或C-末端按順序除去氨基酸，形成梯形肽片段（ladder peptide）。 以一種可控制的化學(xué)模式從N-末端降解，可產(chǎn)生大小不同的一系列的梯形肽片段，所得數(shù)目的肽質(zhì)量由MALDI-TOF-MS測量。 另一種方法涉及羧基肽酶的應(yīng)用，從C-末端除去不同數(shù)目的氨基酸形成肽片段。 化學(xué)法和酶法可產(chǎn)生相對較長的序列，其分子量至以區(qū)別賴氨酸（128。09）和谷氨酰胺（128。06）。 或者，在質(zhì)譜儀內(nèi)應(yīng)用源后衰變（post-source decay， PSD）和碰撞誘導(dǎo)解離（collision-induced dissociation， CID），目的是產(chǎn)生包含有僅異于一個氨基酸殘基質(zhì)量的一系列肽峰的質(zhì)譜。 因此，允許推斷肽片段序列。 肽片段PSD的分析在MALDI反應(yīng)器上能產(chǎn)生部分序列信息。 進(jìn)行肽質(zhì)指紋鑒定。 之后，一個有意義的肽片段在質(zhì)譜儀被選作“母離子”，在飛行至離子反應(yīng)器的過程中降解為“子離子”。 在反應(yīng)器中，用逐漸降低的電壓可測量至檢測器的不同大小的片段。 但經(jīng)常產(chǎn)生不的片段。 現(xiàn)在用肽片段來測序的方法始于70年代末的CID，可以一個三聯(lián)四極質(zhì)譜ESI-MS或MALDI-TOF-MS聯(lián)合碰撞器內(nèi)來完成。 在ESI-MS中，由電霧源產(chǎn)生的肽離子在質(zhì)譜儀的個四極質(zhì)譜中測量，有意義的肽片段被送至**個四極質(zhì)譜中，惰性氣體轟擊使其成為碎片，所得產(chǎn)物在第三個四極質(zhì)譜中測量。 與MALDI-PSD相比，CID穩(wěn)定、強健、普遍，肽離子片段基本沿著酰胺鍵的主架被轟擊產(chǎn)生梯形序列。 連續(xù)的片段間差異決定此序列在那一點的氨基酸的質(zhì)量。 由此，序列可被推測。 由CID圖譜還可獲得的幾個序列的殘基，叫做“肽序列標(biāo)簽”。 這樣，聯(lián)合肽片段母離子的分子量和肽片段距N- C端的距離將足以鑒定一個蛋白質(zhì)。
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