商品屬性：

儲存條件：

RAPA3G Probe qPCR MasterMix(with UDG)儲存：-20℃可保存 2 年。短期使用可放置 2-8℃，保存 3 個(gè)月。如出現(xiàn)白色沉淀溶解后使用，不影響反應(yīng)性能。該試劑經(jīng) 30 次凍融后性能無下降，因此不使用時(shí)請置于-20℃避光保存。

產(chǎn)品介紹：

 RAPA3G Probe qPCR MasterMix 將熱啟動(dòng) RAPA3GDNA 聚合酶、反應(yīng) Buffer、dNTP 染料等試劑預(yù)混在一起，是一種 2×濃度的單組分預(yù)混試劑。該制品不含有 ROX 校正染料，適用于各種熒光標(biāo)記探針，并且適用于各種定量 PCR機(jī)型。優(yōu)化的反應(yīng)緩沖液，使得該制品可用于單重及多重的探針法定量 PCR。制品中的 RAPA3G DNA 聚合酶為第三代 DNA 聚合酶，其具有*高的雜質(zhì)耐受性，其對乙醇、胍鹽、肝素、血清、植物多糖多酚具有極高的耐受性，因此可用于粗樣品的直接定量 PCR 檢測(Direct PCR)。該酶經(jīng)化學(xué)法修飾，在 50℃以下 100%無活性，只有 95 度條件下加熱 5min 后才能完全恢復(fù)酶的活力。因此該系統(tǒng)可以有效抑制非特異性 PCR 擴(kuò)增，極大的提高了 PCR 擴(kuò)增特異性。由于 RAPA3G DNA 聚合酶對 dUTP 具有極強(qiáng)的識別能力，該制品中的 dTTP 核酸堿基完全被 dUTP 所取代，因此擴(kuò)增產(chǎn)物均包含 dUTP，在配合熱敏 UDG（該酶在 95℃熱變性 5min 后不可逆失活，不影響后續(xù) PCR 反應(yīng)）的條件下能達(dá)到*佳的防污染能力。在 10e5 copies 污染物的測試條件下，Ct 推遲 15 個(gè)以上（污染去除能力>99.997%）。

操作方法：

1、按照如下組分配制 20 μl PCR 反應(yīng)體系：
終濃度
2×RAPA3G Probe MasterMix(with UDG) 10 μl 1×
Primer F1 (20 μM) 0.1-0.4 μl 0.1-0.4 μM
Primer R1 (20 μM) 0.1-0.4 μl 0.1-0.4 μM
Probe1 (20 μM) 0.1-0.4 μl 0.1-0.4 μM
其它引物和探針 X
DNA 模板 0.5~2 μl
ddH2O Up to 20 μl
2. 進(jìn)行 Real-Time PCR 反應(yīng),通常采用兩步法，程序如下：
Stage 1 25℃ 2 min 去污染
Stage 2 95??? 5 min 熱啟動(dòng)
Stage 3
40 循環(huán)
95℃ 5 s 變性
60℃ 30 s 收集信號 退火/延伸
注意：退火延伸溫度可在 55-65℃調(diào)整
3. 在多數(shù)情況下，采用兩步法程序可獲得理想的擴(kuò)增效果，在無法達(dá)到預(yù)期理想效果的情況下，也可采用三步法 PCR程序，程序如下：
Stage 1 25℃ 2 min 去污染
Stage 2 95℃ 5 min 熱啟動(dòng)
Stage 3
40 循環(huán)
95℃ 5 s 變性
55℃ 10 s 退火
72℃ 30 s 收集信號 延伸
4. 反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn) Real-Time PCR 的擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線。
注意：消化污染步驟中的溫度設(shè)置可在 25-37℃之間均可，無顯著差異，但高于 42℃以上的溫度會導(dǎo)致熱敏 UDG 消化能力急劇下降。

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