商品屬性：
貨號
規(guī)格
產(chǎn)品名稱
A-PJ1085-20T
20T
pUC57 Simple TA/平端通用克隆載體
產(chǎn)品介紹：
pUC57 Simple TA/平端通用克隆載體 pUC57 Simple 通用克隆載體采用了 TOPO 酶連接技術(shù)，載體預(yù)先偶聯(lián)上 TOPO 酶，當(dāng)加入 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物后，5 min 就可以完成連接反應(yīng)，連接陽性率高。pUC57 Simple 通用克隆載體消除了大部分的常用酶切位點，便于后續(xù)亞克隆。該產(chǎn) 品適用于 Taq 酶擴(kuò)增的含“A”尾巴和高保真酶擴(kuò)增的 PCR 產(chǎn)物的連接，載體含有氨芐青霉素抗性篩選標(biāo)記。 注意：RTS DH5α 凍干感受態(tài)在未溶解狀態(tài)下，可于-20℃長期保存（>2 年），已經(jīng)溶解后，請-60℃以下保存（3 個月）。 主要特征 （1）快速連接，*快僅需 5min；（2）操作簡單，僅需加入載體和片段即可；（3）無需藍(lán)白斑篩選，陽性率高；（4）不包含 任何酶切位點，便于后續(xù)亞克?。?）平末端和 A 尾產(chǎn)物通用。 注意：引物不能磷酸化。 測序引物 正向測序引物：M13F(-47): 5’- CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’； 反向測序引物：M13R(-48): 5’- AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3’；
操作步驟：
1. PCR 產(chǎn)物的純化 1.1 PCR 擴(kuò)增完畢后，電泳檢測產(chǎn)物，如無非特異性擴(kuò)增、無引物二聚體、條帶單一明亮，則可采用 PCR 產(chǎn)物純化試劑 盒純化后用于連接。產(chǎn)物不經(jīng)純化也可以進(jìn)行連接，但效果稍差一些。 1.2 PCR 擴(kuò)增完畢后，電泳檢測產(chǎn)物，如有非特異性擴(kuò)增條帶或引物二聚體，則必須采用膠回收后用于連接。 1.3 PCR 擴(kuò)增模板來源于 Amp 抗性質(zhì)粒，則必須采用膠回收后用于連接。 2. PCR 用量和連接時間 PCR 產(chǎn)物大小 PCR 產(chǎn)物用量 載體用量 摩爾比 連接時間 陽性率 0.1~1kb 2～10ng 1 μl 1: 5~10 5～10min >95% 1~3kb 10～20ng 1 μl 1: 5~10 15～20min >90% >3kb 5ng/kb 1 μl 1: 5~10 30min >85% 3. 連接反應(yīng) 向 0.2 ml EP 管中依次加入如下試劑 成 分 用 量 PCR 產(chǎn)物 0.5~4 μl （用量參考上表） pUC57 Simple Vector 1 μl 加無菌水至總體積為 5 μl 輕輕吹打混合均勻后，室溫（25°C）孵育 5～30min，通常放置 10min。 關(guān)于 PCR 產(chǎn)物的用量說明：在 PCR 產(chǎn)物回收后（在無法進(jìn)行 NanoDrop 測定濃度的情況下），按照一般的經(jīng)驗可估算產(chǎn)物 的用量，原則為：3 μl 回收產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳后，可清晰判斷的情況下，使用 0.5~1 μl 回收產(chǎn)物（約 5~15 ng）進(jìn)行連 接即可?；厥债a(chǎn)物難以觀察的情況下使用 4 μl 回收產(chǎn)物（約 5~10 ng）進(jìn)行連接。使用過高量的 PCR 產(chǎn)物將會導(dǎo)致連接效 率低下，長斑數(shù)量和陽性率急劇下降。
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