不同強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)聯(lián)合葛根素對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠模型的**及其機(jī)制研究

冷超1，2 ，李大威1 ，李強(qiáng)2

( 1． 哈爾濱學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150086; 2． 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬二院，黑龍江 哈爾濱 150086)

 摘 要: 目的: 研究不同強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)聯(lián)合葛根素對(duì)非酒精性脂肪肝( NAFLD) 大鼠模型的**作用和機(jī)制。方法: 調(diào)節(jié)動(dòng)物跑步機(jī)按照 10、15、20 m / min 3 種運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度將大鼠分為低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組、中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組和高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組。運(yùn)動(dòng)組和**組中的大鼠均給予 250 mg / kg 葛根素日 1 次灌胃; 除了對(duì)照組外，各組大鼠均給予高脂飼料喂養(yǎng) 4 周。在 4 周末，檢測(cè)大鼠體質(zhì)量和肝臟重量; 檢測(cè)血漿中透明質(zhì)酸( HA) 、層黏連蛋白( LN) 、三型前膠原( PCⅢ) 、四型膠原( Ⅳ － C) 、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶( ALT) 、天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶( AST) ; 總膽固醇( TC) 、甘油三酯( TG) 、高密度脂蛋白( HDL － C) 、低密度脂蛋白( LDL － C) 、游離脂肪酸( FFA) 和瘦素( Leptin) 的濃度; 檢測(cè)肝臟組織中超氧化物歧化酶( SOD) 和丙二醛( MDA) 的含量; 制作肝臟病理切片檢測(cè)脂肪肝病變情況。結(jié)果: 高脂飲食連續(xù)喂養(yǎng) 4 周能形成 NAFLD 大鼠模型。各運(yùn)動(dòng)組中體質(zhì)量變化和肝臟指數(shù)均低于模型組( P ＜ 0. 05) ; 運(yùn)動(dòng)組和**組與模型組相比 HA、LN、PCⅢ、Ⅳ － C、ALT 和 AST 明顯降低( P ＜ 0. 05) ; 運(yùn)動(dòng)組中和**組與模型組相比 TC、TG、LDL － C、FFA 和 Leptin 明顯降低，而HDL － C 明顯升高( P ＜ 0. 05) ; 中等強(qiáng)度和高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組中肝組織內(nèi)無脂肪沉積。結(jié)論: 葛根素可以降低血脂，改善肝臟功能，但不能減輕 NAFLD 程度; 中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)和高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)聯(lián)合葛根素可以降低血脂、改善胰島素抵抗癥狀、改善肝臟功能和防止 NAFLD 的發(fā)生隨著人民群眾物質(zhì)生活水平的提高，非酒精性脂肪肝 ( non － alcoholic fatty liver disease，NAFLD) 也呈現(xiàn)逐步增加的態(tài)勢(shì)。NAFLD 是指除酒精因素外，導(dǎo)致肝細(xì)胞出現(xiàn)脂肪變性為特點(diǎn)的臨床綜合征，NAFLD 可以分為單純性脂肪肝和脂肪性肝炎兩種類型，而后者可以進(jìn)一步發(fā)展并形成肝纖維化甚至是肝硬化［1 － 2］。研究顯示，NAFLD 與糖尿病、高脂血癥、胰島素抵抗、代謝綜合征等**和癥狀密切相關(guān)。NAFLD 的成因不明，目前研究認(rèn)為除了跟環(huán)境和遺傳等因素有關(guān)外，飲食習(xí)慣也起到了關(guān)鍵作用［3］。NAFLD 的發(fā)病隱匿且病程長，由于肝臟的代償功能強(qiáng)，因此在NAFLD 發(fā)病早期肝臟功能無異常表現(xiàn)，而當(dāng)肝臟功能進(jìn)入失代償期時(shí)，往往脂肪肝已發(fā)展為脂肪性肝纖維化，病情已不可逆轉(zhuǎn)，嚴(yán)重威脅到人體的健康。

目前，** NAFLD 方案主要有 3 種，控制飲食、****和合理運(yùn)動(dòng)［4］。****包括**yao如奧利司他、西布 曲明等，胰島素增敏劑如二甲雙胍和格列齊特等，降血脂藥 物非諾貝特和他汀類**等［5］。上述**雖然可以有效 的降低血脂，但**的不佳反應(yīng)較大，對(duì)改善脂肪肝的效果 不明顯。運(yùn)動(dòng)作為 NAFLD 的非**療法，具有費(fèi)用小，節(jié)約開支，實(shí)施方便的特點(diǎn)，而且適度的有規(guī)律的運(yùn)動(dòng)可以改 善機(jī)體對(duì)胰島素敏感性，延緩 NAFLD 的發(fā)展并*終改善患者的生存質(zhì)量，但單純的運(yùn)動(dòng)對(duì)降低血脂、改善體內(nèi)脂肪代 謝紊亂收效甚微。

葛根為常用中藥，取材方便，價(jià)格低廉。對(duì)葛根的記載始于《神農(nóng)本草經(jīng)》: “味甘，主消渴身大熱嘔吐諸痹，起陰氣，解諸毒。葛谷，主下利，十歲已上。一名雞齊根。生川谷?！?，其具有解肌退熱、生津、透疹、升陽止瀉的功效，多用于**外感發(fā)熱、口渴、斑疹不透、熱痢、脾虛泄瀉、高血壓、 **項(xiàng)強(qiáng)等癥。現(xiàn)代分析化學(xué)研究發(fā)現(xiàn)葛根中有效成分的包括大豆苷、染料木苷、大豆素和葛根素等異黃酮類化合物［6］。葛根素作為中藥葛根中的組要成分之一，具有改善心血管功能、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、降低血糖和改善胰島素抵抗的癥狀。鑒于NAFLD 多伴有高血脂和胰島素抵抗癥狀， 因此本研究通過不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)聯(lián)合葛根素** NAFLD 大鼠模型，觀察各組中血脂變化、胰島素抵抗改善情況和肝臟功能及病理的變化，為臨床上尋找** NAFLD ****和制定科**動(dòng)計(jì)劃供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1． 1    實(shí)驗(yàn)材料

1． 1． 1    實(shí)驗(yàn)動(dòng)物    雄性 Sprague － Dawley( SD) 大鼠 48 只， 6 周齡，體質(zhì)量 180 ～ 200  g，購買于哈爾濱獸醫(yī)研究所。大鼠自購入后飼養(yǎng)于動(dòng)物盒內(nèi)，4 ～ 5 只放置在 1 盒內(nèi)，自然光照，自由飲水，每 2 天更換墊料 1 次，保持盒內(nèi)的環(huán)境清潔。

1． 1． 2    實(shí)驗(yàn)試劑和儀器    葛根素購買于西安瑞林生物科技有限公司( 生產(chǎn)品號(hào) 201501342) ; 高脂飼料( 飼料配方: 豬油 30% 、蔗糖 8% 、酪蛋白 25% 、豆油 3% 、纖維素 7% 、礦物質(zhì) 7% 、糊精 20% ) ; ALT、AST ; HA、LN、PCⅢ、Ⅳ －C 檢測(cè)試劑盒; TC 、TG、HDL － C 和 LDL － C ; SOD、MDA 和 FFA 檢測(cè)試劑盒; Leptin ELISA 試劑盒購自盒;  TBA － 40FR 全自動(dòng)生化檢測(cè)儀; 721 分光光度計(jì); 快速血糖監(jiān)測(cè)儀; 動(dòng)物跑步機(jī)

1． 2    實(shí)驗(yàn)方法

取 48 只雄性 SD 大鼠，隨機(jī)分為 6 組，每組 8 只。調(diào)節(jié)動(dòng)物跑步機(jī)按照 10、15、20 m / min 三種運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度將大鼠分為低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組、中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組和高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組并采用250 mg / kg 葛根素日1 次給予各運(yùn)動(dòng)組動(dòng)物灌胃，同時(shí)采用高脂飼料飼養(yǎng) 4 周。運(yùn)動(dòng)組的訓(xùn)練方式按照文獻(xiàn)進(jìn)行: 低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組按照 10 m / min 進(jìn)行跑步鍛煉，每天進(jìn)行 1 h 直至 4 周末; 中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組按照 15 m / min 進(jìn)行跑步鍛煉， 每天進(jìn)行 1 h 直至 4 周末;高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組按照 20 m / min 進(jìn)行跑步鍛煉，每天進(jìn)行 1 h 直至 4 周末。采用高脂飼料喂養(yǎng)大鼠 4 周建立模型組，并在第 4 周末檢測(cè) NAFLD 大鼠模型是否成功。葛根素 250 mg / kg 灌胃同時(shí)給予高脂飼料喂養(yǎng)大鼠 4 周建立**組。對(duì)照組給予普通飼料喂養(yǎng) 4 周。記錄各組大鼠在實(shí)驗(yàn)前的體質(zhì)量和第 4 周末實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)的體質(zhì)量，計(jì)算大鼠體質(zhì)量平均每周變化的重量。

1． 3    標(biāo)本采集

各組實(shí)驗(yàn)大鼠在第 4 周通過水合氯醛麻醉大鼠后，通過腹主動(dòng)脈采血，檢測(cè)血漿中 HA、LN、PCⅢ、Ⅳ － C、ALT、 中

AST、TC、TG、HDL － C、LDL － C、FFA 和 Leptin 的濃度。取華中出大鼠的肝臟，經(jīng)過稱量后計(jì)算肝臟指數(shù); 取肝臟小葉約 1 醫(yī)g，用生理鹽水沖，去處殘留血液。在勻漿器加入生理鹽水， 藥將肝組織研磨成 0． 5% 、1% 和 10% 的混懸液，在 4000  r /min 離心 15 min，取上清液按照 SOD 和MDA 試劑盒檢測(cè)小學(xué)鼠肝組織內(nèi)SOD 和MDA 的活性; 將部分肝臟用 5% 的福爾刊馬林溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，對(duì)肝組織進(jìn)行 HE 染色，觀察大鼠肝臟病理變化。

11. 4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用過 SPSS 15 統(tǒng)計(jì)軟件處理。以計(jì)量資料結(jié)果采用均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差( x珋± s) 表示，組間比較采用 t 檢驗(yàn)，P＜ 0. 05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 不同運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度對(duì) NAFLD 大鼠體質(zhì)量變化和肝臟指數(shù)的影響將大鼠處死后取出肝臟并稱重，按照公式計(jì)算:  肝臟的重量/ 大鼠的重量  = 肝臟指數(shù)。結(jié)果顯示，模型組與對(duì)照組相比肝臟指數(shù)具和體質(zhì)量變化有顯著性差異( P ＜ 0. 05) ; 低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組、中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組和高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組與模型組   相比肝臟指數(shù)和體質(zhì)量變化具有顯著性差異( P ＜ 0. 05) 。見表 1。

2． 2    不同運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度對(duì) NAFLD 大鼠肝功能指標(biāo)的影響與對(duì)照組相比，模型組中的 HA、LN、PCⅢ、Ⅳ － C、ALT 和 AST 明顯增高 ( P ＜ 0. 05) ; 與模型組相比，低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組、中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組和高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組 3 組中的 HA、LN、PC Ⅲ、Ⅳ － C、ALT 和 AST 明顯升低( P ＜ 0. 05) 。見表 2。

2． 3    不同運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度對(duì) NAFLD 大鼠血脂、瘦素和游離脂肪酸水平的影響與對(duì)照組相比，模型組中的 TC、TG、LDL － C、FFA 和Leptin 明顯增高，而 HDL － C 明顯降低( P ＜ 0. 05) ; 與模型組相比，其余各組中的 TC、TG、LDL － C、FFA 和 Leptin 明顯降低，而 HDL － C 明顯升高( P＜ 0. 05) 。見表 3。

2． 4    大鼠肝臟病理變化

對(duì)照組中，肝小葉形狀規(guī)則完整，肝竇正常，肝細(xì)胞排 列整齊，呈條索狀排列，肝細(xì)胞呈多邊形，核圓，位于細(xì)胞的 中央，細(xì)胞質(zhì)均勻( 插頁ⅩⅩⅨ圖 1) ; 模型組中可見肝小葉形狀欠規(guī)則，肝細(xì)胞排列不規(guī)則，肝細(xì)胞體積明顯增大，部分 細(xì)胞輕度水樣變性，在肝細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有大量的脂滴空泡，細(xì)胞 核偏向一側(cè)( 插頁ⅩⅩⅨ圖 2) ; **組中可見肝小葉形狀欠規(guī)則，部分肝小葉內(nèi)的肝細(xì)胞體積明顯增大，在肝細(xì)胞質(zhì)內(nèi) 有少量的脂滴空泡，細(xì)胞核偏向一側(cè)( 插頁ⅩⅩⅨ圖 3) ; 低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組中肝小葉形狀規(guī)則，肝細(xì)胞體積明顯增大，在肝細(xì) 胞質(zhì)內(nèi)有大量的脂滴空泡( 插頁ⅩⅩⅨ圖 4) ; 中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組中肝小葉形狀規(guī)則完整，肝細(xì)胞排列整齊，呈條索狀排 列，肝細(xì)胞核圓居中，細(xì)胞質(zhì)均勻無脂肪沉積(    插頁ⅩⅩⅨ圖5)  ;  高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組中肝小葉形狀規(guī)則完整，肝竇正常，肝細(xì)胞排列整齊，呈條索狀排列，肝細(xì)胞核圓，位于細(xì)胞的中央， 細(xì)胞質(zhì)均勻無脂肪沉積( 插頁ⅩⅩⅨ圖 6) 。

3 討論

近年來，由于飲食習(xí)慣不合理而引發(fā)肥胖人群增多已經(jīng)成為一種普遍的社會(huì)現(xiàn)象。有研究報(bào)道［1，7］，肥胖人群中伴有 NAFLD 的約占到肥胖總?cè)藬?shù)的 70% 以上，因此有學(xué)者認(rèn)為肥胖特別是中心性肥胖并伴有胰島素抵抗癥狀是 引發(fā)NAFLD的風(fēng)險(xiǎn)因素。NAFLD 與體內(nèi)脂肪的穩(wěn)態(tài)失調(diào) 

綜上所述，單純的****可以明確的降低血脂，改善 胰島素抵抗癥狀，但是對(duì)于**脂肪肝效果不明顯。當(dāng)配 合中等強(qiáng)度和高強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)后，可以改善肝細(xì)胞功能，在降 低血脂、改善胰島素抵抗的情況下，改善脂肪在肝臟內(nèi)的沉 積，實(shí)現(xiàn)標(biāo)本兼治。