杜青 1，趙洪慶 1，王宇紅 1,2*，徐雅嵐 1，楊蕙 2，孟盼 1

(1.湖南省中藥粉體與****省部共建國家重點實驗室培育基地， 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學**附屬醫(yī)院，長沙 410007)

 摘要：目的 針對 NR 受體亞型及其下游分子 CaMKII、SynGAP 的表達情況，探索左歸降糖解郁方對糖尿病并發(fā)抑郁癥模型大鼠海馬神經元突觸功能可塑性的影響。方法 復制糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠模型并隨機分為 4 組：模型組，陽**組(二甲雙胍 0.18 g·kg^-1+鹽酸氟西汀 1.8 mg·kg^-1)，左歸降糖解郁方高、低劑量組(32.82，8.20 g·kg^-1)，以正常大鼠為空白對照組。采用 Morris 水迷宮檢測大鼠的空間學習記憶能力，Western-blotting 實驗檢測大鼠海馬 NR2A、NR2B、CaMKII、SynGAP 的表達情況。結果 與空白對照組比較，模型組大鼠逃避潛伏期延長，空間探索時間減少(P<0.05)，NR 受體亞型NR2A、NR2B 及 CaMKII、SynGAP 的表達明顯減少(P<0.01)；與模型組比較，陽**組和左歸降糖解郁方高劑量組逃避潛伏期顯著縮短(P<0.05)，空間探索時間顯著增加(P<0.05)，NR2A、NR2B、CaMKII、SynGAP 的表達明顯增多(P<0.05 或0.01)。結論 左歸降糖解郁方可以明顯增強糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠的學習記憶能力，改善認知功能障礙，緩解抑郁癥狀， 該作用可能與調節(jié)海馬 NR 受體亞型 NR2A、NR2B 及其下游分子 CaMKII、SynGAP 的表達，保護海馬神經元突觸功能可塑性有關。

關鍵詞：糖尿病并發(fā)抑郁癥；左歸降糖解郁方；NR2A；NR2B；CaMKII；SynGAP

糖尿病作為一種***障礙性慢性**正嚴重影響著人類的生活、健康和生存。全世界約有3.47 億糖尿病患者，而糖尿病并發(fā)抑郁癥(diabetes mellitus with depression ， DD) 的發(fā)生率為8.5%~71.4%[1]，抑郁癥的并發(fā)大大增加了糖尿病的致殘率和致死率。目前，針對 DD 的研究多集中于臨床試驗，極少數(shù)涉及其分子機制，極大地限制了** DD 特效藥的研究及開發(fā)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，DD 模型大鼠腦內谷氨酸異?；罨ｑR出現(xiàn)明顯病理結構損傷，海馬神經元樹突、軸突復雜性降低^[2]，廣泛分布于海馬的 NR 受體活化異常，學習記憶功能減弱。有文獻報道，離子形谷氨酸受體 NR 異?；罨烧{節(jié) CaMK Ⅱ、SynGAP，影響長時程增強(long-term potentiation， LTP)和長時程減弱(long-term decline，LTD)，改變海馬神經元突觸功能可塑性^[3]。而大腦的學習記憶功能與海馬神經元突觸可塑性密切相關。因此， 本實驗通過檢測 NR 受體亞型及其下游分子CaMKII、SynGAP 的表達情況，探索左歸降糖解郁方對糖尿病并發(fā)抑郁癥模型大鼠海馬神經元突觸功能可塑性的保護作用機制。

1 材料

1.1 儀器與試藥

OneTouchⅡ型血糖儀及血糖試紙；HI1210 型水浴鍋；Mini protean 3 cell 型電泳儀；PS-9 型電轉儀；MK3 型酶標儀；吉爾森 P 型移液器(Pipetman) ； Morris 水迷宮。

左歸降糖解郁方^[4]原材料由湖南中醫(yī)藥大學**附屬醫(yī)院制劑科按比例水煎濃縮后制成口服液 100 mL，建立了一測多評的質量控制方法，其主要藥效成分分別為黃芪甲苷≥30 μg·mL^-1、貫葉金絲桃素≥18 μg·mL^-1、姜黃素≥0.4 mg·mL^-1、丹酚酸 B≥1.2 mg·mL^-1、丹皮酚≥0.2 mg·mL^-1。鹽酸二甲雙胍片(湖南湘雅制藥有限公司，批號： 1402115，規(guī)格：0.25 g)；鹽酸氟西汀膠囊(法國Patheon，批號：2087A，規(guī)格：20 mg)；鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)(美國 Sigma 公司，批號： 126A038，規(guī)格：100 mg)，Western blotting **印跡法蛋白抗體 NR2A(批號：Ab14596)、NR2B(批號： Ab65783) 、 CaMK Ⅱ ( 批號： Ab134041) 和SynGap(批號：Ab3344)均購于 Abcam 公司；BCA 蛋白定量試劑盒(Thermo 公司，批號：PICPI23223)， RIPA 組織細胞快速裂解液(上海基爾頓生物，批號：BYL40825)。

1.2 動物

SPF 級，♂，SD 大鼠 50 只，體質量 180~220 g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，生產許可證號： SCXK( 湘)2013-0004 ， 合格證號： 43。

2 方法

2.1 糖尿病并發(fā)抑郁癥動物模型的制備^[5]

SD 大鼠連續(xù) 14 d 每天定時灌胃高脂乳劑(10 mL·kg^-1)后，大鼠禁食不禁水 24 h，尾靜脈一次性注射溶于新鮮配制、4 ℃保存的枸櫞酸緩沖液(0.1 mol·L^-1、pH4.5)的 STZ 溶液(38 mg·kg^-1)，造模 3 d 后，大鼠禁食不禁水 12 h，測定空腹血糖， 選取空腹血糖≥16.00 mmol·L^-1 的大鼠進行 28 d 慢性不可預測性應激。刺激因素包括晝夜顛倒24 h、45°傾籠 24 h、4 ℃冰水浴 5 min、45 ℃熱刺激 5 min、噪音 8 h、潮濕墊料(每籠 200 mL，24 h)、夾尾 1 min。每天進行 1 種，同種刺激不連續(xù)出現(xiàn)。

2.2 分組與給藥

將篩選出來的糖尿病模型大鼠按體質量隨機分為 4 組：模型組、陽**組(二甲雙胍 0.18 g·kg^-1+鹽酸氟西汀 1.8 mg·kg^-1)和左歸降糖解郁方高、低劑量(32.82，8.20 g·kg^-1)組，各組大鼠慢性不可預測應激造模的同時灌胃給藥 28  d。另取正常大鼠10 只作為空白對照組，空白對照組和模型組給予等體積的生理鹽水。

2.3 Morris 水迷宮實驗

將平臺置于 D 象限，Morris 水迷宮內注入剛好沒過平臺 2 cm 的清水(水溫 23~25 ℃)，撒入適量脫脂奶粉減少光反射。第 1~4 天定位航行實驗檢測大鼠學習能力，從不同的方位將大鼠面向池壁放入，觀察 60 s 內大鼠爬上平臺的逃避潛伏期(escape latency，EL)，若 60 s 內還未爬上，將大鼠引導至臺上，并記錄 EL 為 60 s。第 5 天空間探索實驗檢測大鼠記憶能力，撤走平臺，大鼠自對立象限放入，記錄 60 s 內大鼠在 D 象限游泳的時間， 即為空間探索時間(space exploration time，SET)。實驗均在上午 8：00~12：00 內完成，并保持室內其他物體位置不變。

2.4 手術

24 h 禁食不禁水的動物用 10%的水合氯醛(4 mL·kg^-1)麻醉后，固定于手術臺上，腹腔取血， 斷頭取腦，冷凍臺上快速分離雙側海馬于凍存管中，液氮速凍，-80 ℃冰箱保存。Western blotting 檢測 于EP 管中加入裂解液(每 20 mg 組織加 0.15~0.25 mL 裂解液)，快速放入剪成細小碎片的海馬組織， 勻漿，離心12 000 r·min^-1、4 ℃、15 min)，取上清液進行蛋白質定量后-80 ℃保存。BCA 試劑盒中測定上述提取樣品的實際蛋白濃度。根據(jù)目的蛋白的相對分子質量選擇配置 15%濃縮膠與 10%分離膠，上樣(每孔 80 μg)，濃縮膠 80 V、20 min，分離膠120 V、60 min，電泳至標記物溴酚蘭到達凝膠底部即可。采用半干式轉膜法將凝膠中的蛋白分子轉移到 NC 膜上，用去離子水沖洗 NC 膜，再用麗春紅預染后，將目的條帶和內參條帶裁剪下標記后用 TBST 洗去麗春紅。放入裝有 5%的脫脂奶粉液的原位雜交袋中封閉，4 ℃下過夜。用 TBST 洗滌 3 次后加入相應的一抗封閉緩沖液，4 ℃孵育過夜。再用 TBST 洗滌 3 次后加入二抗封閉緩沖液(1∶1 000)，孵育 1 h(37 ℃)。顯色：濾紙吸干膜上液體，放入 ECL 中進行化學發(fā)光檢測。Image2X 軟件掃描圖片得出能反映蛋白表達強度的灰度值。

表 1 各組大鼠學習記憶情況結果( x ± s ，n=8)

2.5 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)分析采用統(tǒng)計軟件 SPSS 16.0，所有計量資料以 x ± s 表示，組間比較采用單因素方差分析，t 檢驗，雙側檢驗， P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 Morris 水迷宮實驗

與空白對照組比較，模型組大鼠 EL 逐漸增加，且后 3 d 差異有顯著性(P<0.01 或 0.05)，SET 顯著減少(P<0.05)。與模型組比較，陽**組和左歸降糖解郁方高劑量組大鼠第 4 天的EL 顯著縮短(P<0.05)，SET 顯著延長(P<0.05)。結果表明，左歸降糖解郁方高劑量能顯著改善糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠的學習記憶能力，緩解抑郁。結果見表 1。

3.2 Western blotting 檢測結果

與空白對照組比較，模型組 NR 受體亞型NR2A、NR2B 及其下游分子 CaMKII、SynGAP 的灰度值比值顯著增加(P<0.01)。與模型組比較，左歸降糖解郁方高劑量組和陽**組 NR2A、NR2B、CaMKII、SynGAP 的灰度值比值顯著減少(P<0.01 或 P<0.05)。結果提示，左歸降糖解郁方可有效調控 NR2A、NR2B、CaMKII、SynGAP 蛋白的表達量。見表 2、圖 1。