藍(lán)斑核Orexin-A 對肥胖抵抗大鼠自發(fā)活動的影響及機(jī)制研究

秦 輝 1，2 孫 姝 1 逄明杰 3 郭菲菲 1 孫向榮 1 公衍玲 4 徐 珞 1△

（1 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室山東青島266021；2 青州云門山衛(wèi)生院山東濰坊262500；

3 青島市立醫(yī)院  山東青島 266000；4 青島科技大學(xué)  山東青島 266042）

摘要目的：探討藍(lán)斑核（LC）orexin-A 對肥胖抵抗（OR）大鼠自發(fā)活動的影響及機(jī)制并進(jìn)一步探究LC 的orexin 調(diào)控是否與肥胖抵抗相關(guān)。方法：雄性SD 大鼠和選擇性培育的OR 大鼠，一側(cè)藍(lán)斑核置管，緩慢均勻注射0.5 μL **（orexin-A 或人工合成腦脊液），用大鼠自發(fā)活動檢測裝置 SPA 箱紅外線活動傳感器測定測大鼠自發(fā)活動（SPA），間接測熱法測定其能量消耗，定量磁共振身體組成分析器檢測大鼠脂體重和瘦體重。大鼠肥胖程度用體脂百分比表示。結(jié)果：與SD 大鼠相比，OR 大鼠的總體重，脂體重和去脂體重顯著降低(P<0.05)。OR 大鼠肥胖程度明顯小于SD 大鼠(P＜0.05)。OR 大鼠在 3 月齡是主要表現(xiàn)為水平活動，6 月齡時垂直活動增加，故OR 大鼠隨年齡增長活動量顯著增多(P＜0.05)。OR 大鼠注射orexinA 增加SPA 的作用比SD 大鼠更強，其主要原因是OR 大鼠水平活動時間明顯高于垂直活動時間。與SD 大鼠相比，OR 大鼠SPA 水平高、體重輕，日間能量消耗和 SD 大鼠無明顯差異，夜間活動消耗更多能量。在 OR 大鼠的 LC 注射 orexin-A 后，兩組高劑量 orexin-A 可顯著增加 SPA(P＜0.05），并呈現(xiàn)劑量依賴性。對于SD 大鼠，只有*高劑量的OXA 才能引起SPA 顯著高于對照組(P＜0.05)。*高劑量的兩組orexin-A 注射后，OR 大鼠 SPA 改變比 SD 大鼠更顯著(250 pmol: P＜0.05 ；500 pmol: P＜0.05)。 結(jié)論：藍(lán)斑核（LC）orexin-A 對肥胖大鼠自發(fā)活動有重要影響，其orexin 調(diào)控與肥胖抵抗相關(guān)。

關(guān)鍵詞：Orexin-A；大鼠自發(fā)活動檢測；藍(lán)斑核；肥胖抵抗性大鼠；能量消耗

中圖分類號：R338.2；R-33；R589.2    文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1673-6273(2016)06-1018-05

前言

嚙齒類動物多個腦區(qū)均可表達(dá) orexin-A[1]，其對動物攝食、能量、活動[2]及體重的調(diào)節(jié)至關(guān)重要[3]。Orexin-A具有刺激攝食[4]、調(diào)節(jié)自發(fā)活動（SPA）和能量消耗的作用[5，6]，既可增加能量攝取又可增加能量消耗。研究表明，orexin-A 可通過改變能量消耗和攝食調(diào)節(jié)SPA，能量消耗比攝食對 SPA 作用更明顯。大鼠**注射orexinA 可使體重減輕，體脂比例降低[7]。Orexin-A 缺乏的大鼠進(jìn)食減少，但由于活動量減少而表現(xiàn)為肥胖[3]。Orex- in-A 對SPA 的作用比對攝食的作用更持久，所需劑量更低[6]。與肥胖大鼠相比，orexin-A 對肥胖抵抗大鼠（OR）的 SPA 促進(jìn)作用更顯著[8,9]。以上數(shù)據(jù)表明，orexin-A 可調(diào)節(jié)SPA，與能量平衡相關(guān)，對于**神經(jīng)系統(tǒng)促進(jìn)SPA 的具體機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

藍(lán)斑核（LC）的神經(jīng)元接收密集的 orexin 神經(jīng)纖維[10]，包含兩種 orexin 受體，受 orexin 調(diào)控[13,15]，其中 orexin-A 可增加 LC神經(jīng)元的活性[16，17，19]。將 orexin-A 注射到 LC 可增加大鼠 SPA而進(jìn)食行為無變化[6]。這些數(shù)據(jù)顯示LC 在orexin-A 介導(dǎo)的行為影響方面有重要調(diào)節(jié)作用。本研究要揭示LC 的orexin-A 調(diào)控肥胖抵抗（OR）大鼠自發(fā)活動的影響及機(jī)制，并探討其是否 與肥胖抵抗相關(guān)。用選擇培育的嚙齒動物的肥胖抵抗模型（OR  大鼠），其表型特征為低脂飲食[14]。已知SD 大鼠和肥胖大鼠在行為、表型以及對orexin-A 的反應(yīng)性上相似，故本研究使用SD 大鼠與 OR 大鼠作比較[9，25]。假設(shè) 1）與 SD 大鼠相比，OR 大鼠能量消耗更多，SPA 水平更高，在LC 注射 oexin-A 后，SPA 增高，肥胖程度降低；2）各組間注射orexin-A 導(dǎo)致的進(jìn)食增加量相近。已證實LC 是orexin-A 增強SPA 的重要核團(tuán)，尚需進(jìn)一步研究顯示LC 是調(diào)控高水平SPA 和OR 表型的重要腦區(qū)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

將雄性SD 大鼠(scxk 魯20080002)和選擇性培育的OR 大鼠各20 只分籠飼養(yǎng)，鼠籠底部為金屬絲，含休息平臺和咀嚼基板，給予 12 ：12 小時明：暗光循環(huán)（06：00 開燈），恒溫環(huán)境（21-22 ℃），大鼠自由進(jìn)食和飲水。每種實驗大鼠隨機(jī)分為兩組。一組大鼠進(jìn)行主成分分析（N =10），**組大鼠（N= 10）用于行為研究。Orexin-A；大鼠自發(fā)活動實驗箱；定量磁共振身體組成分析儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 藍(lán)斑核（LC）置管 采用***（50 mg/kg）或甲苯噻嗪（15 mg/kg）腹腔麻醉大鼠。大鼠一側(cè)LC 置入不銹鋼套管[9,26]。術(shù)后恢復(fù)7 天。

1.2.2 Orexin-A 注射 將orexin-A 溶于人工合成腦脊液，**于 4 ℃保存 48 小時。經(jīng)套管緩慢均勻注射 0.5 μL **[12]。注藥完成后，留置注射器 10 s。在 09:00 到 11:00 之間進(jìn)行注射。將6 月齡大鼠置于開放式八箱間接量熱器內(nèi)，可同時并連續(xù)測，注射間隔至少 48 h。若 orexin-A 組大鼠 SPA 超過對照組大鼠SPA 的 56 %[5]，則計入*終數(shù)據(jù)統(tǒng)計。

1.2.3 SPA 測量  大鼠 SPA 用 SPA 箱紅外線活動傳感器測定[9]。x 和y 軸的兩組紅外線陣列用來檢測水平面上的移動，第三組位置較高的紅外線陣列檢測直立活動，即大鼠活動可由三組 紅外線實時檢測。水平移動（自發(fā)活動）和垂直方位（進(jìn)食或站  立）的活動所需時間通過射線被阻斷的數(shù)據(jù)來估算。自發(fā)活動 即水平移動和垂直方位活動的總時間。實驗開始前，動物置于SPA箱中適應(yīng)2 h。

1.2.4 間接測熱法測能量消耗 測量每個箱內(nèi)（內(nèi)部尺寸長30 cm 寬 26 cm 高 20 cm）的氧耗量和 CO2 產(chǎn)生量，從而計算能量消耗量[11]。在每次檢測前，氣體傳感器要經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)氣體校準(zhǔn)。箱內(nèi)氣流保持在 3.1 L / min，實驗溫度 22 ℃。實驗前大鼠置于箱內(nèi)適應(yīng) 3 天，整個過程自由進(jìn)食和飲水。實驗開始后，每 30 s 測一次 O  和 CO  體積，24 h 后，每 15 min 進(jìn)行一次室內(nèi)空氣的標(biāo)準(zhǔn)測定。呼吸交換率定義為24 h 呼吸交換率的平均值?？偰芰肯臑?4 h 熱量測量的總和。靜息能量消耗是指光照條件下的*低代謝率，并推算24 h 總量。非靜息能量消耗是指總能量消耗減去靜息能量消耗。

1.2.5脂體重和瘦體重檢測用定量磁共振身體組成分析儀（EchoMRI-900)[2]來測定脂體重和瘦體重。大鼠稱重后置于圓柱形樹脂玻璃箱內(nèi)。將該玻璃箱放入身體組成成分分析器，檢 測需1-2 min。百分比代表體脂和非脂肪組織，可由優(yōu)良脂肪和非脂肪組織比率以及總體重來分別計算。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析  所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，用GraphPad Prism3.0 軟件分析，多組間均數(shù)比較采用雙因素方差分析，P<0.05 為差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OR 大鼠和SD 大鼠的能量消耗與SPA與SD 大鼠相比，OR 大鼠的總體重，脂體重和去脂體重顯著降低(P<0.05，圖 1，A-C)。在 3.25 月齡時，OR 大鼠的去脂體重明顯低于SD大鼠(P＜0.05) (圖1C)。大鼠肥胖程度用體脂百分比表示，5 月齡時，OR 大鼠肥胖程度明顯小于 SD 大鼠(P＜0.05，圖 1B)。OR 大鼠在 3 月齡是主要表現(xiàn)為水平活動，6月齡時垂直活動增加(圖 1，動 D 和E) ，故 OR 大鼠在 6 月齡時比 3 月齡時活動量顯著增多(P＜0.05)。與 SD 大鼠相比，OR 大鼠體重輕，24 h SPA 高(圖 1，A 和 F)，提示 OR 大鼠雖然體重較輕，瘦體重降低，但其能量消耗要高于SD 大鼠。靜息狀態(tài)下，OR 大鼠消耗能量顯著低于非靜息狀態(tài)下的能量消耗(P＜0.05)。 若以 24 h 優(yōu)良能量來看，OR 大鼠在靜息時消耗的能量較少(P＜ 0.05)，而兩組大鼠非靜息能量消耗的差別無顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。與 SD 大鼠相比，OR 大鼠SPA水平高、體重輕，日間能量消耗和SD 大鼠無明顯差異。以上數(shù)據(jù)表明，雖然OR 大鼠瘦體重含量低，但夜間活動消耗更多能量。OR 大鼠體重較輕，能量消耗與SD 大鼠相同，說明大鼠身體活動與能量消耗增加有關(guān)。

 2.2 藍(lán)斑核（LC）注射OXA 對SPA 的影響  將orexin-A (62.5, 125, 250, 500 pmol/0.5 μL) 或安慰劑注射到藍(lán)斑 [6，9]。注射后，連續(xù)測量 SPA 140 min 。由于 orexin-A注射過程也能增加SPA，此效應(yīng)獨立于**作用并可持續(xù)20 min，故前 20 min 的結(jié)果不計入*終數(shù)據(jù)統(tǒng)計[12]。在 OR 大鼠的LC 注射 orexin-A 后，SPA 增加。圖 2 顯示注射三種高劑量orexin-A 后，OR 大鼠活動量明顯超過 SD 大鼠  (P＜0.01) ，在LC 注射orexinA 后 1 h，OR 大鼠(P＜0.05)和 SD 大鼠(P＜0.05)的SPA 均顯著增加。對于OR大鼠，兩種高劑量orexin-A 可顯著增加SPA(P＜0.05 兩種劑量)，并呈現(xiàn)劑量依賴性。500 pmol劑量的OXA引起的總的活動量顯著高于62.5 pmol(P＜0.05)。與之相反，對于SD大鼠，只有*高劑量的OXA才能引起SPA 顯著高于對照組(P＜0.05)。在注射后1 h-2 h 間隔期間，兩組大鼠間以及不同處理方式間對SPA 的影響無差異(P＞0.05)。注射后 2 h，OR 大鼠對orexin-A 的應(yīng)答增強（圖 2F）。*高劑量的兩組orexin-A 注射后，SPA 顯著增加，OR 大鼠改變比 SD 大鼠更明顯(250 pmol: P＜0.05 ；500 pmol: P＜0.05)。OR大鼠中，250 pmol劑量的orexin-A對SPA 增加的作用顯著高于對照組(P＜0.05)，SD 大鼠中，500 pmol 劑量的 orexin-A 相對于對照組顯著增加大鼠 SPA (P＜0.05)。 與 SD 大鼠相比，OR 大鼠注射orexin-A 增加SPA的作用更強，其主要原因是OR 大鼠水平活動時間明顯高于垂直活動時間(圖 2, A 和B)。注射 2 h 后，OR大鼠orexinA 組水平活動顯著增加，垂直活動無明顯變化。與之相反，SD 大鼠垂直活動增加而水平活動無明顯變化。

綜上所述，OR 大鼠非靜息能量消耗較高，SPA 增加，肥胖傾向減低。LC的特異性orexin信號傳導(dǎo)是OR 大鼠和肥胖大鼠行為及肥胖傾向出現(xiàn)差異的主要因素。LC中orexin 信號提高可促進(jìn)負(fù)能量平衡，降低肥胖傾向。目前發(fā)現(xiàn)人類肥胖癥的 **可將目標(biāo)轉(zhuǎn)向orexin 系統(tǒng)和行為方向以增加SPA。