實時熒光定量PCR 即 Real time PCR(也稱實時定量PCR)定量PCR已經(jīng)從基于凝膠的低通量分析發(fā)展到高通量的熒光分析技術(shù)，即實時定量PCR。實時熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國Applied Biosystems公司推出，由于該技術(shù)不僅實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點。實時定量PCR (real-time quantitative PCR)是指在PCR指數(shù)擴(kuò)增期間通過連續(xù)監(jiān)測熒光信號強(qiáng)弱的變化來即時測定特異性產(chǎn)物的量，并據(jù)此推斷目的基因的初始量，不需要取出PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離。目前實時定量PCR作為一個極有效的實驗方法，已被廣泛地應(yīng)用于分子生物學(xué)研究的各個領(lǐng)域。
實時熒光定量PCR 技術(shù)的主要應(yīng)用：
1. DNA 或RNA 的定量分析：包括病原微生物或病毒含量的檢測,轉(zhuǎn)基因動植物轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)的檢測，RNAi 基因失活率的檢測等
2. 基因表達(dá)差異分析：例如比較經(jīng)過不同處理樣本之間特定基因的表達(dá)差異(如處理、物理處理、化學(xué)處理等 )，特定基因在不同時相的表達(dá)差異以及cDNA 芯片或差顯結(jié)果的確證
3. 基因分型：例如SNP 檢測，甲基化檢測等
Realtime PCR 常用的兩種方法分別為：Sybr green（熒光染料摻入法） 和Taqman probe （探針法）
SYBR green
在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。
此方法適用：
1、靈敏度高：使用SYBR可使熒光效果增強(qiáng)到1000倍以上
2、通用性好,不需要設(shè)計探針,方法簡便,省時,價格低廉。
3、通用型方法，在國內(nèi)外科研中普遍使用。
4、高通量大規(guī)模的定量PCR檢測
5、專一性要求不高的定量PCR檢測。
Taqman Probe
PCR擴(kuò)增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團(tuán)和一個淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時，報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步
此方法適用：
1、具有高適應(yīng)性和可靠性，實驗結(jié)果穩(wěn)定重復(fù)性好，特異性更高。
2、適用于擴(kuò)增序列專一的體系的檢測。
3、樣品中靶基因含量過低的定量PCR檢測。
4、靶基因的特異序列較短，無論怎樣優(yōu)化引物設(shè)計條件都不能解決。
5、存在與靶基因同源的序列，在PCR中容易出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，對特異性要求較高的定量。
6、廣泛用于人類傳染病的診斷和病原定量,在動物病原體基因的檢測,畜禽產(chǎn)品的檢驗檢疫,生物制品的鑒定。