氯霉素?;D(zhuǎn)移酶重組蛋白的分離、純化:
1. NTA層析柱的準(zhǔn)備:在層析柱中加入1 mL NTA介質(zhì),并分別用8 mL 去離子水,8 mL上樣緩沖液洗滌。
2. 重組蛋白的變性裂解:在冰浴中凍融菌體沉淀,加入5 mL上樣緩沖液, 用吸管抽吸重懸,超聲波破裂菌體,用振蕩器等輕柔的混勻樣品60 min,4℃ 12000 rpm 離心 30 min,將上清吸至一個干凈的容器中,并棄沉淀。取10 ul 上清樣品用于SDS-PAGE 分析。
3. 上清樣品以10-15 mL/h 流速上Ni2+-NTA柱,收集流出液,取10 ul樣品用于SDS-PAGE 分析。
4. 洗脫雜蛋白:用Washing Buffer以10-15 mL/h流速洗柱,直至OD280 = 0.01分步收集洗脫液,約3-4 h,取10 ul洗脫開始時的樣品用于SDS-PAGE 分析。
5. 洗脫目標(biāo)蛋白:用Elution Buffer洗柱,收集每1 mL 級分,分別取10 ul樣品用于SDS-PAGE 分析。