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qPCR 實(shí)驗(yàn)Ct 值偏大或普通 PCR 產(chǎn)量低分析
日期：2024-12-29 07:51
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摘要：
逆轉(zhuǎn)錄后的 qPCR 實(shí)驗(yàn) Ct 值偏大或者普通 PCR 產(chǎn)量低。
1、 RNA 模板質(zhì)量差，需要重新制備 RNA 模板，可通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)量。
2、 逆轉(zhuǎn)錄后的 cDNA 中含有高濃度的模板 RNA 和逆轉(zhuǎn)錄試劑成分，可能會(huì)對(duì)后續(xù)的PCR 產(chǎn)生抑制作用，所以可以適當(dāng)梯度提高 cDNA 稀釋比例（通常來(lái)說(shuō)可將 cDNA 原液稀釋5-10倍，其zui 佳模板加入量以擴(kuò)增得到的 Ct 值在20-30個(gè)循環(huán)為好）。
3、 起始的 RNA 模板量低，需要減少稀釋倍數(shù)或增加 RNA 模板量。
4、 基因本身原因（復(fù)雜和長(zhǎng)度），可以重新設(shè)計(jì)復(fù)雜基因...
逆轉(zhuǎn)錄后的 qPCR 實(shí)驗(yàn) Ct 值偏大或者普通 PCR 產(chǎn)量低。
1、 RNA 模板質(zhì)量差，需要重新制備 RNA 模板，可通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)量。
2、 逆轉(zhuǎn)錄后的 cDNA 中含有高濃度的模板 RNA 和逆轉(zhuǎn)錄試劑成分，可能會(huì)對(duì)后續(xù)的PCR 產(chǎn)生抑制作用，所以可以適當(dāng)梯度提高 cDNA 稀釋比例（通常來(lái)說(shuō)可將 cDNA 原液稀釋5-10倍，其zui 佳模板加入量以擴(kuò)增得到的 Ct 值在20-30個(gè)循環(huán)為好）。
3、 起始的 RNA 模板量低，需要減少稀釋倍數(shù)或增加 RNA 模板量。
4、 基因本身原因（復(fù)雜和長(zhǎng)度），可以重新設(shè)計(jì)復(fù)雜基因的引物，避免復(fù)雜結(jié)構(gòu)?；蛘哂萌椒ǔ绦蚧蜓娱L(zhǎng)兩步法程序的延伸時(shí)間。
5、 逆轉(zhuǎn)錄或者定量產(chǎn)品性能差，可以通過(guò)做平行不用品牌產(chǎn)品對(duì)比實(shí)驗(yàn)，對(duì)比逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)品性能。