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PCR反應(yīng)主要成份Taq DNA聚合酶分析
日期：2024-12-29 07:47
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摘要：
一般Taq DNA聚合酶活性半衰期為92.5℃ 130 min，95℃ 40 min， 97℃ 5 min。現(xiàn)在人們又發(fā)現(xiàn)許多新的耐熱的DNA聚合酶，這些酶的活性在高溫下活性可維持更長時(shí)間。
Taq DNA聚合酶的酶活性單位定義為74℃下，30 min，摻入10 nmol/L dNTP到核酸中所需的酶量。Taq DNA聚合酶的一個(gè)致命弱點(diǎn)是它的出錯(cuò)率，一般PCR中出錯(cuò)率為2×10-4 核苷酸/每輪循環(huán)，在利用PCR克隆和進(jìn)行序列分析時(shí)尤應(yīng)注意.在100 μl PCR反應(yīng)中，1.5-2單位的Taq DNA聚合酶就足以進(jìn)行30輪循環(huán)。
所用的酶量可根據(jù)DNA、引物及其它因素的變化進(jìn)行適當(dāng)?shù)脑鰷p.酶量過多會...
一般Taq DNA聚合酶活性半衰期為92.5℃ 130 min，95℃ 40 min， 97℃ 5 min。現(xiàn)在人們又發(fā)現(xiàn)許多新的耐熱的DNA聚合酶，這些酶的活性在高溫下活性可維持更長時(shí)間。
Taq DNA聚合酶的酶活性單位定義為74℃下，30 min，摻入10 nmol/L dNTP到核酸中所需的酶量。Taq DNA聚合酶的一個(gè)致命弱點(diǎn)是它的出錯(cuò)率，一般PCR中出錯(cuò)率為2×10-4 核苷酸/每輪循環(huán)，在利用PCR克隆和進(jìn)行序列分析時(shí)尤應(yīng)注意.在100 μl PCR反應(yīng)中，1.5-2單位的Taq DNA聚合酶就足以進(jìn)行30輪循環(huán)。
所用的酶量可根據(jù)DNA、引物及其它因素的變化進(jìn)行適當(dāng)?shù)脑鰷p.酶量過多會使產(chǎn)物非特異性增加，過少則使產(chǎn)量降低。
反應(yīng)結(jié)束后，如果需要利用這些產(chǎn)物進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，需要預(yù)先滅活Taq DNA聚合酶， 滅活Taq DNA聚合酶的方法有：
（1）PCR產(chǎn)物經(jīng)酚:氯仿抽提，乙醇沉淀。
（2）加入10 mmol/L的EDTA螯合Mg2+ 。
（3） 99-100℃加熱10 min。目前已有直接純化PCR產(chǎn)物的Kit可用。