深圳菲特立科技有限公司推出德國**微生物快速檢測系統(tǒng)RVLM ,可快速定量的檢測各類致病菌。詳情請登陸www.szfitly.com 活菌總數(shù);
大腸菌群;
大腸桿菌;
腸道桿菌科;
金黃色葡萄球菌;
綠膿桿菌;
沙門氏菌;
李斯特菌;
腸球菌;
亞硫酸鹽還原梭狀芽孢桿菌;
產(chǎn)氣莢膜梭菌;
霉菌(曲霉屬**、曲霉菌);
酵母菌。
中華人民共和國國家標準 GBT 7918.4-1987 化妝品微生物檢測 綠膿桿菌
綠膿桿菌 在自然界分布甚廣，空氣、水、土壤中均有存在。對人有致病力，常引起人皮膚化膿感染，特別是**、**、眼部**患者被感染后，常使病情惡化，并可引起敗血癥，因此，在化妝品衛(wèi)生標準中規(guī)定不得檢出綠膿桿菌。
1 方法提要
根據(jù)本菌生物學(xué)特征:革蘭氏陰性桿菌，氧化酶陽性，能產(chǎn)生綠膿菌素。此外還能液化明膠，還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，在42℃條件下生長等，可與類似菌相區(qū)別。
2 培養(yǎng)墓和試劑
2.1 SCDLP液體培養(yǎng)基
見 GB 7 9 18.1- 87《化妝品微生物標準檢驗方法總則》。
2.2 十六烷**基澳化餒培養(yǎng)基
成分 : 牛肉膏3g
蛋 白陳 log
氯 化 鈉 5g
十六 烷 三 甲 基 澳 化 按 0.3g
瓊脂 20g
蒸餾 水 1000m1
制法 : 除 瓊脂外，將上述成分混合加熱溶解，調(diào)PH為7.4- 7.6， 加入瓊脂,115'C ( 101b)20min**后，制成平板備用。
2. 3 乙酞胺培養(yǎng)基
成分 : 乙酸胺10.Og
氯化 鈉 5.0g
無水 磷 酸 氫 二 鉀 1.39 g
無水 磷 酸 二 氫 鉀 0.73 g
硫酸 鎂 ( M gS O , · 7H , O ) 0.5g
酚 紅 0.0 12g
瓊脂 20g
蒸餾 水 1000m1
制法 :除 瓊脂和酚紅外，將其他成分加到蒸餾水中，加熱溶解，調(diào)PH為7.2,加入瓊脂、酚紅，121C(15lb)20 min高壓**后，制成平板備用。
2. 4 綠膿菌色素測定用培養(yǎng)基
成分 : 蛋白陳20g
抓 化鎂 1.4g
硫酸 鉀 108
瓊脂 18g
甘油 ( 化 學(xué) 純 ) log
燕 餾 水 l000ml
制法 :將 蛋白陳、抓化鎂和硫酸鉀加到蒸餾水中.加溫使溶解，調(diào)州至7.4.加入瓊脂和甘油，加熱溶解，分裝于試管內(nèi)，115'C (10 1b)20 min高壓**后，制成斜面?zhèn)溆谩?/span>
2. 5 明膠培養(yǎng)基
成分 : 牛肉膏39
蛋 白 陳 5g
明膠 120g
蒸 餾 水 1000ml
制法 :取 各成分加在燕餾水中浸泡20min,隨時攪拌加溫使溶解，調(diào)pH至7.4 ，分裝于試管內(nèi)，經(jīng)115'C( 101b )20 m in**后，直立制成高層備用。
2.6 硝酸鹽蛋白陳水培養(yǎng)基
成分 : 蛋白陳log
酵母 浸 青 3呂
硝 酸 鉀 2g
亞硝 酸 鈉 0.5g
燕 餾 水 loooml
制法 :將 蛋白陳和醉母浸膏加到蒸餾水中，加溫使溶解，調(diào)pH為7.2,煮沸過濾后補足液量，加入硝酸鉀和亞硝酸鈉，溶解混勻，分裝到加有小倒管的試管中，115'C( 101b )20 m in**后備用。
2.了 普通瓊脂斜面培養(yǎng)基
成分 : 蛋白陳log
牛 肉 青 3g
抓 化 鈉 5g
瓊脂 15g
蒸餾 水 loooml
制法 :除 瓊脂外，將其余成分溶解于燕餾水中，調(diào)叫為7.2-7.4，加入瓊脂，加熱溶解，分裝試管，
121'C (15 1b) 15 min高壓**后。制成斜面?zhèn)溆谩?/span>
3 儀器
3. 1 培養(yǎng)箱:37'C .42 C。
3. 2 錐形燒瓶。
3. 3 試管。
3. 4 **平皿。
3. 5 **刻度吸管。
3. 6 顯微鏡。
3. 7 載玻片。
3. 8 接種針、接種環(huán)。
3. 9 電爐。
3. 10高壓**鍋。
4 操作步吸
4.1 增菌培養(yǎng):取1:10樣品稀釋液lOm l加到90mlSCDLP液體培養(yǎng)基中，置37℃培養(yǎng)18-24h,如有綠膿桿菌生長，培養(yǎng)液表面多有一層薄菌膜，培養(yǎng)液常呈黃綠色或藍綠色。
注:如無SCDLP液體培養(yǎng)基時，可用普通肉湯培養(yǎng)基。
植臉含防腐劑的化妝品時，在每1000.1普通肉湯中加1g卵磷脂 , 7g 吐溫80。
4.2 分離培養(yǎng):從培養(yǎng)液的薄菌膜處挑取培養(yǎng)物，劃線接種在十六烷**基澳化按瓊脂平板上，置37℃培養(yǎng)18-24h。凡綠膿桿菌在此培養(yǎng)基上，其菌落扁平無定型，向周邊擴散或略有蔓延，表面濕潤，菌落呈灰白色，菌落周圍培養(yǎng)基常擴散有水溶性色素，此培養(yǎng)基選擇性強，大腸艾希氏菌不能生長，革蘭氏陽性菌生長較差。在缺乏 十 六烷**基澳化按瓊脂時也可用乙酞胺培養(yǎng)基進行分離，將菌液劃線接種于平皿中，放37℃培養(yǎng)24h，綠膿桿菌在此培養(yǎng)基上生長良好，菌落扁平，邊緣不整，菌落周圍培養(yǎng)基略帶粉紅色，其他菌不生長。
4.3 染色鏡檢:挑取可疑的菌落，涂片，革蘭氏染色，鏡檢為革蘭氏陰性者應(yīng)進行氧化酶試驗。
4.4 氧化酶試驗:取一小塊潔凈的白色濾紙片放在**平皿內(nèi)，用無菌玻瑞棒挑取綠膿桿菌可疑菌落涂在濾紙片上，然后在其上滴加一滴新配制的1%二甲荃對笨二胺試液，在15-30s之內(nèi)，出現(xiàn)粉紅色或紫紅色時，為氧化酶試驗陽性，若培養(yǎng)物不變色，氧化酶試驗陰性.
4. 5 綠膿菌素試驗:取可疑菌落2-3個，分別接種在綠膿菌素測定用培養(yǎng)基上，置37'C培養(yǎng)24h，加入氯仿3-5ml，充分振蕩使培養(yǎng)物中的綠膿菌素溶解于抓仿液內(nèi)，待抓仿提取液呈藍色時，用吸管將氯仿移到另一試管中并加入1N的鹽酸1 ml左右，振蕩后，靜置片刻。如上層鹽酸液內(nèi)出現(xiàn)粉紅色到紫紅色時為陽性，表示被檢物中有綠膿菌素存在。
4.6 硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗:挑取被檢的純培養(yǎng)物，接種在硝酸盆膝水培養(yǎng)基中，置37℃培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果。凡在硝酸鹽陳水培養(yǎng)基內(nèi)的小倒管中有氣體者，即為陽性，表明該菌能還原硝酸鹽，并將亞硝酸鹽分解產(chǎn)生氮氣。
4.7 明膠液化試驗，取綠膿桿菌可疑菌落的純培養(yǎng)物，穿刺接種在明膠培養(yǎng)基內(nèi)，置371C培養(yǎng)24h,取出放冰箱10^-30min，如仍呈溶解狀時即為明膠液化試驗陽性，如凝固不溶者為陰性。
4.8 42℃生長試驗:挑取純培養(yǎng)物，接種在普通瓊脂斜面培養(yǎng)基上，放在41^-42℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24-48h，綠膿桿菌能生長，為陽性，而近似的熒光假單胞菌則不能生長。
5 檢驗結(jié)果報告
被檢 樣 品 經(jīng)增菌分離培養(yǎng)后，經(jīng)證實為革蘭氏陰性桿菌，氧化酶及綠膿菌素試驗皆為陽性者，即可報告被檢樣品中檢出有綠膿桿菌。如綠膿菌素試驗陰性而液化明膠、硝酸鹽還原產(chǎn)氣和42 C生長試驗三者皆為陽性時，仍可報告被檢樣品中有綠膿桿菌。
附加說明:
本標準由中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院環(huán)境衛(wèi)生監(jiān)測所歸口。
本標準由“化妝品微生物標準檢驗方法”起草小組起草。
本標準主要起草人周淑玉。
本標準由中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院環(huán)境衛(wèi)生監(jiān)測所負責解釋。