RT-PCR實驗有三步：抽提RNA，RT，PCR。
試驗前注意：
1. 做RT前必需測RNA濃度，逆轉(zhuǎn)錄體系對RNA量還是有一些要求，常用500ng或1ug。
2. RT按要求做，一般不會出太大問題。
3. PCR如需擴長片段，則對前兩步要求較高，需要有完整的cDNA存在，不是單改變Mg2+濃度、退火溫度能解決的。
試驗過程：
實驗器具：
1、 移液槍：1ml、200μl、20μl、10μl、2μl
2、 吸頭：1ml、200μl、20μl
3、 勻漿管：5ml
4、 吸頭臺：放置1ml吸頭的一個，放置20μl吸頭的一個
5、 EP管：1.5ml、0.2ml、100μl
6、 試劑瓶：2個60ml的棕色試劑瓶(廣口，帶蓋)1個125ml的白色試劑瓶(放無水乙醇
7、 量筒：50ml、250ml、500ml
8、 容量瓶：250ml、500ml、1000ml
9、 試管架：5ml、1.5ml、20μl
10、 鹽水瓶：250ml、500ml各2個備用，一個裝無水乙醇，另一個裝DEPC水
11、 鋁制飯盒：4個
12、 塑料小飯盒：1個
13、 大瓷缸：2個
14、 錫泊紙：一卷
15、 卷紙：2卷
16、 三角燒瓶：帶蓋，稍大
實驗器具的處理與準(zhǔn)備：
1、 塑料制品：(包括槍頭、EP管、勻漿管等)先將DEPC水從容量瓶中倒入瓷缸中，將塑料制品逐個浸泡其中，其中小槍頭需要吸管打入DEPC水，過夜，然后高壓，再烤干備用，實驗前將槍頭等放入吸頭臺，再高壓一次(EP管)。
2、 玻璃制品：泡酸過夜，沖洗干凈，蒙錫紙烤干備用(DEPC水泡)(洗凈后先泡1‰DEPC過夜，再烤干)。
3、 勻漿器：(包括剪刀、鑷子)先洗凈后，再高壓(不需要泡DEPC
試驗試劑：
1、 DEPC水：吸出1ml放在1000ml雙蒸水中配成1‰DEPC水，放在1000ml容量瓶中靜置4小時備用。
2、 75%乙醇：用無水乙醇+DEPC水配，然后放-20℃保存(其中DEPC水需先高壓)。
3、 異丙醇：放入棕色瓶中。
4、 氯仿：放入棕色瓶中。
5、 瓊脂糖
幾種緩沖液的配制：
1、 電泳緩沖液： Tris? ?54g??硼酸 27.5g 0.5M EDTA 20ml pH8.0 蒸溜水 1000ml。
2、 5×TBE (貯存液)再將5×TBE稀釋10倍成0.5TBE就可以在電泳時使用(即工作液濃度)，如取50ml貯存液加入450ml水——→500ml工作緩沖液。
3、 上樣緩沖液：0.25%溴酚藍 0.25%二甲苯青FF 30%甘油 6×緩沖液，4℃保存
瓊脂糖凝膠的配制：
1、 1.0%： 1.0g瓊脂糖加入100ml電泳緩沖液中，微波爐中火30秒至沸騰，熔化的瓊脂物冷卻至60℃時加入10mg/ml溴化乙錠2.5μl，充分混勻，將溫?zé)岬哪z倒入已置好梳子的膠膜中，在室溫下放置30-45min后進行電泳。
2、 1.5%:同上，將瓊脂糖的量改為1.5g。
Rt-PCR材料：
Taq酶(含MgCl2 Buffer)
dNTP
oligo(dT)15
promega M-MLV
promega (Buffer)
RNasin
DEPC
Trizol
Invitrogen Life technologies
Marker
引物合成
1、 內(nèi)參照：
正義：5′—ACCACAGTCCATGCCATCAC—3′
反義：5′—TCCACCACCCTGTTGCTGTA—3′
β-actin
正義：5′—CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC—3′
反義：5′—TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT—3′
2、 par-4:
正義：5′—GGGACCTCGGAACTCAAC—3′
反義：5′—TGTATCTGCCTGGGACTG—3′
3、 退火溫度計算
2(A+T)+4(G+C)
正反義平均數(shù)，再上下波動度(±4℃，或±5℃)
4、 引物各合成5 OD，每OD一瓶分裝好
5、 引物稀釋：
加DEPC水量為(μl)= ? nmol / OD × 管上所標(biāo)OD數(shù)×100 稀釋為10p mol / μl 濃度的引物溶液
試驗步驟：
1. RNA提取(略參見RNA實驗技術(shù)版塊)
2. cDNA的合成：
逆轉(zhuǎn)錄體系的組成：
50ul PCR體系：
10×PCRbuffer 5ul
MgCl2 3ul(2.0mM)
10mMdNTPs 1ul
sense primer 1ul(1umol/l)
antisense primer 1ul(1umol/l)
cDNA 1.5ul
DEPC處理水 36.7ul
Taq 酶 0.8ul
總體積 50ul
3. PCR反應(yīng)條件：
94 ℃ 5min
94 ℃ 1min
退火溫度 40sec
72 ℃ 50sec
72 ℃ 7min
4 ℃ 0sec
29 cycles
取出后4℃ 5分鐘后-20℃保存或走電泳
4. 電泳：約1.25小時
先將1-10μl左右PCR產(chǎn)物，加已點在紙上的溴酸蘭，反復(fù)吸打混勻后進行電泳，一般電流為10mA，電源100V，電泳30分鐘，紫外燈下觀察。
注意事項：
1、 逆轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵步驟是立即冰水浴。
2、 Rt時，先打開PCR預(yù)熱30分鐘。
3、 RNA抽提前，打開離心機預(yù)冷。
4、 在所有RNA實驗中，關(guān)鍵的因素是分離得到全長的RNA。而實驗失敗的主要原因是核糖核酸酶(RNA酶)的污染。在實驗中，一方面要嚴(yán)格控制外源性RNA酶的污染;另一方面要較大限度地抑制內(nèi)源性的RNA酶。RNA酶可耐受多種處理而不被滅活，如煮沸、高壓**等。
5、 做RT前必需測RNA濃度，逆轉(zhuǎn)錄體系對RNA量還是有一些要求，常用500ng或1ug。
6、 RT按要求做，一般不會出太大問題。
7、 PCR，按常規(guī)。但如需擴長片段，則對前兩步要求較高，需要有完整的cDNA存在，不是單改變Mg2+濃度、退火溫度能解決的。
8、 注意避免有毒、有害試劑傷害自己和他人：氯仿、溴化乙錠(EB)、酚、異硫氰酸胍、紫外線等
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