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Western blot 條帶分析

Western blot 條帶分析

跑過WB的童鞋都知道，有時候顯影出來的結果簡直逆天到讓你懷疑人生，懷疑自己。不過，世間萬物均有跡可尋，在這里，小編根據自身經驗以及其他小伙伴的經歷，對各種奇葩結果進行一番總結歸納，快來瞅瞅吧，說不定就有你的呢。

 

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問題 可能原因 驗證或解決辦法
背景高 封閉不充分/未加封閉劑 延長封閉時間
更換合適的封閉劑（脫脂奶粉、血清、BSA等）
一抗?jié)舛冗^高 增加一抗稀釋倍數(shù)
抗體孵育溫度過高 4℃孵育
二抗非特異性結合 設置二抗對照（不加一抗），降低二抗?jié)舛?
一抗或二抗與封閉劑有交叉反應 在孵育和洗滌液中加入Tween-20以減少交叉反應
洗膜不充分 增加洗滌次數(shù)
膜不合適 NC膜比PVDF膜背景低
膜干燥 保證充分的反應液，避免出現(xiàn)干膜現(xiàn)象
沒有陽性條帶或很弱 一抗、二抗等不匹配 訂購試劑時認真選取一抗與組織種屬，一抗與二抗或/和底物與酶系統(tǒng)之間相匹配的抗體及底物。可通過設置內參來驗證二級檢測系統(tǒng)的有效性
一抗或/和二抗?jié)舛鹊? 增加抗體濃度，延長孵育時間
封閉劑與一抗或二抗有交叉反應 封閉時使用溫和的去污劑，如Tween-20
更換封閉劑（脫脂奶粉、BSA、血清或明膠等）
一抗不識別目的物種的靶蛋白 檢查說明書，或做ClustalW比對，設陽性對照
樣本中無靶蛋白或靶蛋白含量過低（抗原無效） 設置陽性對照，如果陽性對照有結果，但標本沒有則可能是標本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。后者可增加標本上樣量至少每孔20-30ug蛋白,樣本制備時使用蛋白酶抑制劑,或分級提取目的蛋白
轉膜不充分,或洗膜過度 使用麗春紅S檢測轉膜效果,PVDF膜需浸透,需正確的轉膜操作,勿過度洗膜
過度封閉 使用含0.5%脫脂奶粉或無脫脂奶粉的抗體稀釋液，或更換封閉劑，減少封閉時間
一抗失效 使用有效期內抗體,分裝保存,避免反復凍融取用, 工作液現(xiàn)配現(xiàn)??
二抗受疊氮鈉抑制 所用溶液和容器中避免含有疊氮鈉(HRP的抑制劑)
酶和底物失效 直接將酶和底物進行混合，如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內、有活性的酶聯(lián)物,使用新鮮的底物
曝光時間過短 延長曝光時間
多非特異性條帶或條帶位置不對 細胞傳代次數(shù)過多，導致其蛋白表達模式分化 使用原始或傳代少的細胞株，或多做平行實驗
體內表達的蛋白樣本具有多種修飾形式：乙?；?、磷酸化、甲基化、烷基化、糖基化等 查文獻，使用去修飾的試劑使蛋白恢復其正確的大小
蛋白樣本降解 使用新鮮制備的標本，并使用蛋白酶抑制劑
新蛋白或同族蛋白分享同種表位的不同剪接方式 查其它文獻報導，或BLAST搜尋，使用說明書報導的細胞株或組織
一抗?jié)舛冗^高 降低抗體濃度，可以減少非特異性條帶
二抗?jié)舛冗^高 產生非特異性結合 降低抗體濃度，增加二抗對照
選擇特異性更強，只針對重鏈的二抗
抗體未純化 使用單克隆或親和純化的抗體，減少非特異條帶
蛋白存在二聚體或多聚體 SDS-PAGE電泳上樣前，煮沸10 min， 以增強蛋白質解聚變性
背景有白色/黑色斑點 轉膜時有氣泡或抗體分布不均 盡量去除氣泡，抗體孵育時保持搖動
抗體與封閉劑結合 過濾封閉劑
暗片現(xiàn)白條帶 一抗或二抗加入過多，導致高濃度HRP把底物消耗過快 稀釋抗體的濃度
目的條帶過低/過高 SDS-PAGE膠濃度選擇不合適 調整膠濃度，分子量大的蛋白用低濃度膠，分子量小的蛋白用高濃度膠
“微笑”條帶 遷移過快 降低電泳速度，低溫電泳（冷室）
電泳溫度過高
條帶拖尾 蛋白量太大 摸索*適蛋白量
一抗?jié)舛忍? 降低一抗?jié)舛?，減少孵育時間，同時洗滌時嚴格按照要求時間和次數(shù)進行
一抗孵育時間太長
出現(xiàn)重影 壓片時，輕微移動了一段距離 X光片放上去之后，就不要動了，即使放歪了也沒關系
出現(xiàn)非均一性背景 膜干燥 在每一步的操作過程中，都要注意不要讓膜干燥
某個條帶變形 凝膠中存在氣泡或不溶性顆粒 配膠過程中要小心，使用無雜質的液體
條帶呈啞鈴狀 凝膠配制不合格 充分混勻，防止膠凝固后不均一
拔梳子時要小心，避免膠孔變形
*邊緣條帶彎曲 電泳電流不均一 換用新的電泳槽
不使用兩邊的兩孔
條帶出現(xiàn)縱向條紋 樣品中含有不溶性顆粒 去除樣品中的不溶性顆粒
轉膜不充分 膜沒有完全均勻濕透 使用100% methanol浸透膜
靶蛋白分子量小于10,000 選擇小孔徑的膜，縮短轉移時間
靶蛋白等電點等于或接近轉移緩沖液pH值 可嘗試使用其他緩沖液如CAPS緩沖液（pH 10.5)或使用低pH值緩沖液如乙酸緩沖液
甲醇濃度過高 過高甲醇濃度會導致蛋白質與SDS分離，從而沉淀在凝膠中，同時會使凝膠收縮或變硬，從而抑制高分子量蛋白的轉移。降低甲醇濃度或者使用乙醇或異丙醇代替
轉移時間不夠 對于厚的膠以及高分子量蛋白需要延長轉移時間