【原理】

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在微孔條上預包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物雌二醇和微孔條上預包被的偶聯(lián)抗原競爭雌二醇抗體，加入酶標記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物雌二醇的含量成負相關，與標準曲線比較可得出相應殘留物雌二醇的含量。

【試劑盒技術指標】  

規(guī)       格：96孔/盒

靈 敏 度： 0.1ppb

檢測時間： 75min

雌二醇試劑盒樣本定量檢測下限

組織（蝦、魚）……………………………………0.2ppb

豬肉/肝 雞肉/肝 ……………………………………  2ppb

飼料………………………………………………… 20ppb

尿液…………………………………………………0.6ppb

交叉反應率

雌二醇………………………………………………100%

己烯雌酚…………………………………………… 90%

樣本回收率

飼  料……………………………………………90±10%

組  織……………………………………………85±10%

尿  液……………………………………………70±10%

【試劑盒組成】  

1、微量測試孔：每條8孔，一板12條

2、標準液×6瓶：（1ml/瓶）0ppb、0.1 ppb、 0.3 ppb、0.9ppb、2.7ppb、8.1 ppb

3、酶標記物      12ml………………………………紅色帽

4、抗體工作液    7ml………………………………藍色帽

5、底物液 A液   7ml………………………………白色帽

6、底物液 B液   7ml……………………………… 黑色帽

7、終 止 液       7ml……………………………… 黃色帽

8、20X濃縮洗滌液  40ml…………………………白色帽

9、5X濃縮復溶液   50ml…………………………透明帽

雌二醇試劑盒【所用儀器、試劑】  

儀器：微孔板酶標儀450nm/630nm、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀/氮氣吹干裝置、均質(zhì)器、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g ）

微量移液器：單道 20μl～200μl、100μl～1000μl、多道 250μl

試   劑：乙腈、氫氧化鈉、氯仿、丙酮、濃磷酸（含量85%）

【實驗前溶液配制】

配液1、6M H₃PO₄ 溶液100ml 濃H₃PO₄（含量85%）加去離子水150ml混合均勻。

配液2、1M NaOH 溶液4gNaOH加去離子水100ml溶解。

配液3、2M NaOH 溶液8gNaOH加去離子水100ml溶解。

配液4、乙腈-丙酮混合液V乙腈-V丙酮  =  4 : 1

配液5、將5X濃縮復溶液用去離子水按照1：4稀釋（1份濃縮復溶液+4份去離子水）用于樣本的復溶。

配液6、將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。

【樣本前處理步驟】  

處理任何樣本時，都必須注意：

（a）實驗中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時要更換吸頭。

（b）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進行清潔，以避免污染干擾實驗結(jié)果。

（a）飼料樣本

1、      稱取2±0.05g搗粹后的飼料樣本，加入8ml乙腈，振搖5min，15℃，4000r/min以上，離心10min；

2、      取2ml上清液，60℃氮氣/空氣吹干；

3、      加入0.5ml氯仿，渦動20s，加入2ml 1M NaOH，渦動30s，4000r/min以上，離心5min；

4、      取1ml上清液，加入100μl 6M H₃PO₄，渦動5s；

不同樣本按如下方法稀釋：

配合料：取50μl，加入950μl稀釋后的復溶液，渦動混勻30s，取50μl 用于檢測。

濃縮料/預混料：取25μl，加入975μl稀釋后的復溶液，渦動 混勻30s，取50μl 用于檢測。

配合料稀釋倍數(shù)：100    

濃縮料、預混料稀釋倍數(shù)：200 

（b）組織（雞肉/肝、豬肉/肝、蝦、魚）

1、      稱取2±0.05g勻漿后的樣本，加入6ml乙腈-丙酮混合液，振搖5min，15℃，4000r/min以上，離心10min。

2、      取3ml上清液，60℃氮氣/空氣吹干。加入0.5ml氯仿，渦動20s，加入2ml 2M NaOH，渦動30s，4000r/min以上，離心

           5min。

3、      取1ml上清液，加入200μl 6M H₃PO₄，渦動5s。

4、      加入3ml乙腈萃取，振蕩5min，室溫4000r/min以上，離心10min，取上層有機相， 60℃氮氣/空氣吹干。

5、      用1ml稀釋后的復溶液溶解干燥的殘留物，混勻30s。

雌二醇試劑盒不同樣本按如下方法稀釋：

       蝦魚：直接取50μl水相用于檢測。豬肉/肝、雞肉/肝：取50μl水相加入450μl稀釋后 的復溶液，渦動混合30s；取50μl用于檢

                測。

       蝦魚稀釋倍數(shù)：2      

       豬肉/肝、雞肉/肝稀釋倍數(shù)：20

（c）尿液

1、      取2ml尿液到離心管中，室溫4000r/min以上，離心10min，直至清亮；

2、      移取1ml清亮尿液至離心管中，加入1ml　1M NaOH強烈振蕩5min；

3、      加入100μl  6M H₃PO₄，渦動30 s；

4、      再加入8ml氯仿進行萃取，振蕩5min。15℃，4000r/min以上，離心10min；

5、      去掉上層的水相，取下層有機相4 ml，60℃氮氣/空氣吹干；

6、      用3ml稀釋后的復溶液干燥的殘留物，混合30s；

取50μl 用于檢測。

樣本稀釋倍數(shù)：6

【酶標**分析程序】  

操作步驟：

1、      從4℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑，置室 溫（20-25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

2、      取出框架及需要數(shù)量的微孔，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。

3、      編號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。

4、      加標準品或樣本50μl/孔到各自的微孔中，然后加抗體50μl/孔，用蓋板膜封板，輕輕振蕩混勻。37℃環(huán)境中反應30min。

5、      取出將孔內(nèi)液體甩干，用洗液250μl /孔，洗板4－5次，每次間隔15-30s，用吸水紙拍干（拍干后未被**的氣泡可用干凈的

          槍頭刺破）。

6、      每孔加入酶標記物100μl，蓋板膜蓋板后置37℃環(huán)境中反應30min。重復步驟6。

7、      顯色：每孔加入底物液A液50μl， 再加B液50μl，輕輕振蕩混勻，37℃環(huán)境中避光顯色15min。

8、      測定：每孔加入終止液50μl，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，在5min內(nèi)讀完數(shù)

          據(jù)），測定每孔OD值。

【結(jié)果判定】  

 結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與其所含雌二醇成負相關。

1、粗略判定

用樣本的平均吸光度值與標準吸光度值比較即可得出其濃度范圍(ppb)。假設樣本1的吸光度值為0.310， 樣本2的吸光度值為0.820，標準液吸光度值分別是：0ppb為1.510；0.1ppb為1.320；0.3ppb為1.030；0.9ppb為0.660； 2.7ppb為0.389；8.1ppb為0.198。則樣本1的濃度范圍是2.7ppb-8.1ppb； 樣本2的濃度范圍是0.3 ppb-0.9 ppb。乘以其對應的稀釋倍數(shù)即為樣本中雌二醇實際含量。

2、定量分析

（1）百分吸光率的計算，標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以**個標準（0標準）的吸光度值，再乘以100%，即：

B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml標準溶液的平均吸光度值

（2）標準曲線的繪制與計算

以標準品百分吸光率為縱坐標，以雌二醇濃度（ng /ml）的半對數(shù)為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數(shù)即為樣本中雌二醇實際含量。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準確、快速分析。（歡迎來電索?。?b>  

3、標準曲線

B/B0 (%)

                                      雌二醇(ppb) [μg/kg]

                         圖1：雌二醇檢測試劑盒的回歸曲線

4、再現(xiàn)性

%CV

                          雌二醇(ppb) [μg/kg]

                圖2：雌二醇檢測試劑盒的精密度

由多個不同的實驗結(jié)果確定了精密度，圖2顯示出雌二醇檢測試劑盒的精密度情況，獲得的標準吸收值的變異系數(shù)（%CV）對相應雌二醇濃度作曲線，可以看到在全部范圍內(nèi)變異系數(shù)如此之低，可以得到很好的再現(xiàn)性。

雌二醇試劑盒【注意事項】  

1、      使用前將所有試劑溫度回升至室溫20-25℃。試劑及標本沒有回到室溫（20-25℃）會導致所有標準的OD值偏低。

2、      在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會伴隨著出現(xiàn)標準曲線不成線性，重復性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應立即進行

          下一步操作。

3、      混合要均勻，否則會出現(xiàn)重復性不好的現(xiàn)象。

4、      反應終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。

5、      不要使用過了有效日期的試劑盒，稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值的變化。不要交換使用不同批號的盒中試劑。

6、      不用的微孔板放進自封袋密封；標準物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

7、      顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應當棄之。0標準的吸光度值小于0.5個單位（A_450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質(zhì)。

8、      該試劑盒*佳反應溫度為37℃，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

【儲存】

 原包裝應儲存于2～8℃保鮮冷藏，切勿冷凍。

【有效期】

 有效期12個月;生產(chǎn)日期、有效期、生產(chǎn)批號見外包裝。

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